牛傳染性鼻氣管炎病毒重組gD蛋白間接ELISA的建立與應(yīng)用.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(IBR)，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。IBR被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類傳染病，也是我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物和國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易中規(guī)定的重點(diǎn)檢疫對(duì)象。因此，加強(qiáng)IBR診斷技術(shù)的研究工作對(duì)預(yù)防和控制本病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，國(guó)內(nèi)還沒有商品化的檢測(cè)IBR的診斷試劑，口岸動(dòng)物IBR的檢測(cè)處于嚴(yán)重依賴國(guó)外試劑盒的狀況。 本研究用大腸桿菌表達(dá)了牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因，將重組

2、蛋白純化后作為包被抗原建立了檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的間接ELISA診斷方法。gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染細(xì)胞的表面，是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是IBR診斷試劑中特異性抗原的首選蛋白。本實(shí)驗(yàn)將IBRVgD基因的重組質(zhì)粒pET30a-gD轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到了大量可溶性表達(dá)的重組蛋白，采用Ni柱親和層析法在非變性的條件下成功地純化了重組蛋白，純化的重組蛋白濃度為0.128mg/ml，純度為96％

3、。Westernblot和間接ELISA檢測(cè)證明純化后的重組蛋白可以被牛傳染性鼻氣管炎病毒抗血清所識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。將大腸桿菌表達(dá)的牛傳染性鼻氣管炎病毒重組gD蛋白，純化后作為包被抗原建立了檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的間接ELISA診斷方法，將其命名為gD-ELISA。通過一系列試驗(yàn)，確定了底物液中TMB最佳使用濃度(0.4mg/ml)；DMSO最佳使用濃度(15％)；0.75％過氧化氫尿素最佳使用濃度(25.6μl/ml);

4、重組抗原最佳包被濃度(6.4μg/ml)；最佳封閉液(含10％馬血清的PBST)和最佳封閉時(shí)間(1h)；血清樣本最佳稀釋度(1:80)和最佳作用時(shí)間(1.5h)；酶標(biāo)二抗最佳工作濃度(1:5000)和最佳作用時(shí)間(1h)；底物最佳顯色時(shí)間(15min)和終止液最佳作用時(shí)間(5min)：判定臨界值(PR≥38.0為陽(yáng)性，PR＜30.8為陰性)。交叉反應(yīng)試驗(yàn)表明，該重組抗原與其它常見5種牛病的陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。阻斷試驗(yàn)表明，IBRV細(xì)

5、胞培養(yǎng)液能在很大程度上阻斷重組抗原與陽(yáng)性血清的反應(yīng)，而對(duì)陰性血清沒有明顯的影響。重復(fù)性試驗(yàn)表明，批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)小于5％，批間重復(fù)的變異系數(shù)小于15％。與病毒中和試驗(yàn)相比，符合率、敏感性和特異性分別為84.1％、85.0％和83.4％。與本實(shí)驗(yàn)室已建立的IBRV全病毒ELISA診斷方法相比，符合率、敏感性和特異性分別為91.9％、94.2％和90.2％。應(yīng)用IBRVgD-ELISA檢測(cè)了國(guó)內(nèi)11個(gè)省份的2012份血清樣本，得出國(guó)內(nèi)平均