牛傳染性鼻氣管炎抗體乳膠凝集檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)，是一種由牛皰疹病毒1型(BHV-1)引起家養(yǎng)或野生牛的傳染病。主要分為呼吸道型和生殖道型，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為傳染性鼻氣管炎、結(jié)膜炎、以及傳染性的膿性外陰道炎、睪丸炎、流產(chǎn)。該病在世界范圍都廣泛流行，陽性牛的檢出和撲殺是控制該病最有效方法，但是對(duì)于出欄量大的一些發(fā)展中國家無法做到這些，故采取免疫接種的方式預(yù)防本病。雖然有許多國家在進(jìn)行控制措施

2、，但是只有澳大利亞、丹麥、芬蘭、瑞典、瑞士、挪威、意大利的波爾查諾省以及德國的上弗蘭肯和上普法爾茨地區(qū)以及根除了該病。
　　 對(duì)于本病的檢測(cè)，目前在國際貿(mào)易中OIE推薦的方法包括精液中病毒的分離、real-time PCR、病毒中和實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。但是這些方法要不比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，或需要特定的儀器設(shè)備，同時(shí)要求檢測(cè)人員具有一定的實(shí)驗(yàn)技能。所以本研究旨在研究一種快速簡(jiǎn)便可用于現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)方法。
　　 本研究利用蔗糖梯度

3、離心，分離純化出加工完整的BHV-1病毒粒子，利用純化的病毒粒子免疫小鼠，從而制備單克隆抗體。然后將其致敏空白乳膠，確定最佳的致敏和封閉條件。然后利用血清中和試驗(yàn)對(duì)建立的方法進(jìn)行了敏感性實(shí)驗(yàn)，接著進(jìn)行了特異性、重復(fù)性試驗(yàn)。最后運(yùn)用建立的LAT方法檢測(cè)了新疆、江蘇、內(nèi)蒙古地區(qū)的512份臨床樣品。主要包括如下幾點(diǎn)工作：
　　 1.BHV-1單克隆抗體的制備
　　 (1)在MDBK細(xì)胞系上增殖擴(kuò)大BHV-1病毒，利用超高速蔗糖

4、梯度離心分離純化病毒粒子，獲得加工完整的病毒粒子。(2)利用純化的病毒粒子，滅活后免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過融合、篩選、單克隆化獲得三株穩(wěn)定分泌針對(duì)BHV-1的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。擴(kuò)大后腹腔注射BALB/c制備腹水。
　　 2.牛傳染性鼻氣管炎LAT方法的建立
　　 (1)使用純化病毒粒子致敏空白乳膠，并確定最佳致敏條件和封閉條件，制備乳膠診斷抗原；接著完成了特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)。(2)用LAT方法與血清中和試驗(yàn)

5、方法同步檢測(cè)新疆和內(nèi)蒙古送檢的252血清，總符合率為96.4%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有很高的符合率，差異不顯著(P>0.05)，從而建立了一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)IBRV抗體的乳膠凝集方法。(3)用所建立的方法對(duì)來自內(nèi)蒙古、新疆、江蘇等地區(qū)的512份臨床隨機(jī)樣品進(jìn)行檢測(cè)。共檢測(cè)出177份陽性血清，其陽性率為34.6%，這與其他實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果也是基本一致的。
　　 總之，本研究成功制備BHV-1單克隆抗體，建立乳膠凝集快速診斷，為該病的防