牛副流感病毒3型HN基因-牛傳染性鼻氣管炎重組病毒的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）和牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus3, BPIV3）均為牛呼吸道疾病綜合征（Bovine respiratory disease complex, BRDC）的重要病原。牛呼吸道疾病綜合征是一個(gè)嚴(yán)重阻礙世界養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的疾病，具有很高的感染率和死亡率。IBRV是雙鏈DNA病毒，基因組為1

2、30 kb左右，可允許外源基因插入，是重組活載體疫苗的候選病毒載體，已有很多外源病毒基因成功地插入到了IBRV基因組中。牛副流感病毒3型，是引起犢牛肺炎的主要病原之一，引起的感染在世界范圍內(nèi)流行。牛副流感病毒3型的HN基因是病毒主要的誘導(dǎo)中和抗體的保護(hù)性抗原，被廣泛應(yīng)用于疫苗研究，如重組腺病毒載體疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗及納米顆粒疫苗。因此，構(gòu)建攜帶BPIV3 HN基因的重組IBRV活載體疫苗，可同時(shí)防控牛呼吸道疾病綜合征中的IBR

3、V和BPIV3的混合感染，起到一苗雙防的效果。
　　目的：牛傳染性鼻氣管炎可通過(guò)空氣傳播，其傳播速度快、距離遠(yuǎn)、效率高，難以防御。隨著集約化、規(guī)?；竽辽a(chǎn)的發(fā)展，IBRV氣溶膠在流行病傳播中占據(jù)重要地位。(1)建立牛傳染性鼻氣管炎群體監(jiān)測(cè)技術(shù)，為傳染病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)報(bào)預(yù)警提供配套技術(shù)；（2）構(gòu)建牛傳染性鼻氣管炎病毒活載體；（3）制備牛副流感病毒3型HN蛋白的多克隆抗體，為重組病毒的鑒定提供物質(zhì)支撐；（4）構(gòu)建攜帶牛副流感病毒3型H

4、N基因的牛傳染性鼻氣管炎重組病毒，為IBRV和BPIV3的防控奠定基礎(chǔ)。
　　方法：（1）通過(guò)常規(guī)PCR，克隆IBRV gD基因，并將其連入pEASY-T3載體中，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒。對(duì)SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序中的熒光染料濃度、引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了可用于養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中氣載牛傳染性鼻氣管炎病原檢測(cè)方法，并對(duì)規(guī)?；膛?chǎng)進(jìn)行氣溶膠樣本的持續(xù)監(jiān)測(cè)。（2）利用pEGFP-N1和IBRV DNA為模板，獲得G

5、FP表達(dá)盒和TK（gE）基因上下游片段，經(jīng)拼接獲得獲得含GFP表達(dá)盒且打靶基因缺失的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，經(jīng)同源重組獲得IBRV活載體。（3）以BPIV3的基因組為模板，采用RT-PCR方法獲得HN基因，構(gòu)建HN基因原核表達(dá)載體。經(jīng)誘導(dǎo)、純化獲得融合蛋白。將純化的重組蛋白免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，評(píng)估其誘導(dǎo)中和抗體的能力。（4）以IBRV DNA和BPIV3 DNA為模板，構(gòu)建含HN表

6、達(dá)盒的gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV gE-/EGFP+活載體基因組DNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)同源重組獲得攜帶HN基因的IBRV重組病毒。
　　結(jié)果：（1）通過(guò)對(duì)SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件的優(yōu)化，最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：2×SYBR Premix Ex Taq II10μL，模板2μL，上游引物和下游引物（0.25μmol/L）各0.5μL，RNase Free ddH2O7μL。最佳反應(yīng)條件為預(yù)變性

7、95℃30s，然后按照95℃變性5s、63℃退火延伸30s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為95℃5s、65℃60s、95℃ Continuous；最后50℃30s結(jié)束反應(yīng)。溫度轉(zhuǎn)換率為20℃/s。在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。用建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法對(duì)BVDV、BPIV-3、BCoV、BRV進(jìn)行檢測(cè)，這些病原核酸的檢測(cè)均為陰性。該檢測(cè)可檢出核酸的最低模板拷貝數(shù)為101拷貝/μL，而常規(guī)PCR所能檢出的核酸的

8、最低陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)分別為102拷貝/μL。對(duì)7個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)進(jìn)行氣溶膠樣本的持續(xù)監(jiān)測(cè)，檢測(cè)了247份樣本，有2個(gè)牧場(chǎng)多次監(jiān)測(cè)到牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸陽(yáng)性，與個(gè)體檢測(cè)數(shù)據(jù)相符。（2）利用pEGFP-N1和IBRV DNA為模板，通過(guò)PCR獲得了GFP表達(dá)盒、TK基因上下游片段、gE基因上下游片段。通過(guò)重疊PCR、酶切、回收目的片段、連接和轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段，最終獲得含GFP表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pcDNA3.1-TKup-GFP-TKdown

9、和pcDNA3.1-gEup-GFP-gEdown。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，利用綠色熒光蛋白和病毒蝕斑克隆篩選，獲得了IBRV活載體，PCR檢測(cè)結(jié)果表明GFP基因已經(jīng)插入到了重組病毒IBRV的基因組中。（3）利用BPIV3的基因組作為模板，擴(kuò)增HN，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），確定IPTG誘導(dǎo)最佳濃度為1mmol／L，最佳誘導(dǎo)溫度為37℃，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6h。誘導(dǎo)、純化后，經(jīng)Pier

10、ce BCA Protein Assay Kit測(cè)定蛋白濃度為412μg/ml。將純化后的BPIV3病毒蛋白HN蛋白和pET32a(+)空載蛋白與等體積的弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑乳化，免疫新西蘭兔，獲得的效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗血清。（4）以IBRV DNA為模板，獲得gE基因上下游片段。經(jīng)重疊PCR獲得片段gEup-HN-gEdown，將其插入載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建了含HN表達(dá)盒的gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pcDNA3.1-gEup

11、-HN-gEdown。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV gE-/EGFP+突變株基因組DNA共轉(zhuǎn)染MDBK，采用反向病毒蝕斑篩選法，獲得了IBRV gE-/HN+突變株。PCR鑒定結(jié)果表明HN基因在重組病毒中穩(wěn)定存在。利用制備的多克隆抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明HN基因已表達(dá)。病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明，重組病毒的增殖能力與親本病毒相似。
　　結(jié)論：（1）建立并優(yōu)化了奶牛場(chǎng)環(huán)境氣溶膠群體監(jiān)測(cè)技術(shù)，為傳染病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)報(bào)預(yù)警提供配

12、套技術(shù)。對(duì)規(guī)?；膛?chǎng)進(jìn)行氣溶膠樣本的持續(xù)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)牛群中帶毒牛和隱性感染牛的存在，為牛傳染性鼻氣管炎的早期預(yù)警及群體監(jiān)測(cè)提供了關(guān)鍵技術(shù)。（2）構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白GFP的IBRV活載體，為IBRV活載體疫苗的研究提供物質(zhì)支撐。（3）構(gòu)建了BPIV3 HN基因的原核表達(dá)載體，利用pET32a原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了較純的重組蛋白，免疫新西蘭兔后可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體血清。（4）成功構(gòu)建了攜帶HN基因的IBRV重組病毒，Western blot