雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定及S1、N基因的序列分析.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(IB)是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病。此病在世界各地均有發(fā)生,給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV是單股RNA病毒,該病毒基因可由于點(diǎn)突變和重組而發(fā)生變異,因此IBV的血清型較多,已達(dá)30余種之多。不同血清型毒株之間僅有部分或無交叉保護(hù)作用,從而給本病的防治帶來困難。我國目前雖然已廣泛使用IB疫苗,但由于IBV的易變異型,IB仍然呈高度流行趨勢,尤其是在已

2、免疫雞群中也常常爆發(fā)IB,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,對IB的發(fā)生、流行和病原變異的分析和研究,將為該病的綜合防控提供有用的參考依據(jù)。
　　 本研究對江蘇地區(qū)疑似雞傳染性支氣管炎的病料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室病毒分離和鑒定。結(jié)果表明,四株分離株均能引起胚體發(fā)育不良,個(gè)體小,頭、爪合抱,呈蜷縮現(xiàn)象；其尿囊液不能凝集雞紅細(xì)胞,但經(jīng)2％胰酶處理后能凝集雞紅細(xì)胞；在雞胚內(nèi)對NDV LaSota株有干擾作用；動(dòng)物回歸試驗(yàn)復(fù)制出的病例表現(xiàn)出的臨床癥狀、病

3、理變化與自然發(fā)病的病例相同。所以可初步斷定所分離的四株病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。
　　 應(yīng)用RT—PCR方法擴(kuò)增出四株IBV分離株的S1基因和N基因,將其進(jìn)行了克隆、序列測定及分析。構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析了四株IBV分離株與參考毒株之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。
　　 四株IBV分離株S1基因的長度分別由1611、1611、1650、1641個(gè)核苷酸組成,分別編碼537、537、550、547個(gè)氨基酸。四株分離株之間S1基因核苷

4、酸序列同源性和氨基酸序列同源性分別為80.0％～97.4％、82.9％～95.9％。分離株JS3、JS4與其它參考毒株同源性較低,在72.9％～81.8％之間,基因序列內(nèi)有大量的堿基突變、插入和缺失。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,分離株JS1、JS2與呼吸型毒株歸屬于一個(gè)分支,分離株JS3、JS4與國內(nèi)分離的腎型毒株歸于一個(gè)分支。四株分離株的S蛋白裂解位點(diǎn)均為RRFRR,與標(biāo)準(zhǔn)呼吸型毒株裂解位點(diǎn)一致。
　　 四株IBV分離株N基因的長度均

5、為1230bp,編碼409個(gè)氨基酸。四株分離株之間N基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分別為86.7％～96.1％、88.0％～98.3％。N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹也顯示分離株JS1、JS2與JS3、JS4位于兩個(gè)分支。N基因序列內(nèi)沒有堿基的插入與缺失,但是大量的點(diǎn)突變造成氨基酸的替代,氨基酸的替代也出現(xiàn)在N蛋白的三個(gè)保守堿性氨基酸區(qū)內(nèi)。
　　 以上分析結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)分離的IBV分離株存在較為廣泛的基因突變、插入和缺失,同時(shí),IB

6、V毒株間的基因重組也可能是IBV變異株產(chǎn)生的另一主要原因。本實(shí)驗(yàn)中分離株JS1、JS2屬于呼吸型毒株；分離株JS3、JS4屬于腎型毒株。
　　 本研究將IBV N基因定向插入原核表達(dá)載體pET-32a,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-N,并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21(DE3),通過IPTG的誘導(dǎo)表達(dá),將表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測,重組質(zhì)粒得到高效表達(dá)。Western blot分析顯示,N基因表達(dá)產(chǎn)物能夠與IBV多抗血清IgG反應(yīng),具有