傳染性支氣管炎病毒番鴨分離株的鑒定及N基因片段序列分析.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病。病毒血清型復(fù)雜,所致疾病的臨床表現(xiàn)差異很大,主要癥狀為呼吸困難、產(chǎn)蛋下降、腎炎和腺胃炎等。近年來(lái),IB的流行呈上升趨勢(shì),尤其是腎型、腺胃型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒基因組為線狀、不分節(jié)段、單股正鏈RNA,全長(zhǎng)27.6kb,主要結(jié)構(gòu)蛋白為纖突(S)蛋白、膜(M)蛋白和核衣

2、殼(N)蛋白,其中唯一位于膜內(nèi)的由409個(gè)氨基酸組成的N蛋白,能特異性結(jié)合到引導(dǎo)RNA上,參與病毒RNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。以往,人們對(duì)IBV的研究主要集中在S1基因上,認(rèn)為N基因在IBV的進(jìn)化中高度保守;但近年研究發(fā)現(xiàn),N基因也存在廣泛的變異,并且這些變異分布于抗原表位和相關(guān)功能區(qū)域,預(yù)示不同毒株N基因變異可能導(dǎo)致病毒的某些生物特性發(fā)生改變。
　　 2008年12月我省莆田某種番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疾病:產(chǎn)蛋高峰期番鴨產(chǎn)蛋銳減,產(chǎn)蛋率

3、從85％降低到30％～40％,經(jīng)兩個(gè)月后逐漸恢復(fù)至60％,蛋質(zhì)量下降,軟殼蛋、畸形蛋增多,孵化率降低,病番鴨伴有一過(guò)性呼吸道癥狀,死亡率極低,剖檢發(fā)病番鴨發(fā)現(xiàn)卵泡膜充血,其它實(shí)質(zhì)器官無(wú)明顯病變。取病番鴨卵巢組織進(jìn)行病毒分離(毒株命名為PTFY株),經(jīng)雞胚傳代、理化特性試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、電鏡觀察、測(cè)序?qū)Ρ鹊辱b定PTFY株為IBV,結(jié)果如下:
　　 1、經(jīng)9日齡SPF雞胚傳代,第5代開(kāi)始出現(xiàn)侏儒胚、尿囊腔有大量白色絮狀物沉積。理化特性

4、試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)經(jīng)氯仿、乙醚、去氧膽酸鈉處理后的病毒,其感染力降低。經(jīng)電鏡負(fù)染觀察發(fā)現(xiàn)病毒粒子直徑為100nm,有囊膜,略呈球形,囊膜上可見(jiàn)花瓣樣纖突,符合冠狀病毒特性。
　　 2、取第5代尿囊液,用1％胰酶處理不同時(shí)間后測(cè)血凝價(jià),發(fā)現(xiàn)血凝價(jià)隨胰酶消化時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,4h達(dá)到最高,隨后處于穩(wěn)定狀態(tài);取不同培養(yǎng)時(shí)間(36h、48h、72h、96h、120h)雞胚尿囊液,用1％胰酶處理后測(cè)血凝價(jià),發(fā)現(xiàn)血凝價(jià)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

5、r>　　 3、將病毒液通過(guò)點(diǎn)眼、滴鼻感染SPF雛雞,第3天開(kāi)始出現(xiàn)呼吸困難、精神萎頓等臨床癥狀。但是剖檢并未有明顯的特征病變。對(duì)照組無(wú)異常。后取腎臟組織經(jīng)RT-PCR檢測(cè),證明其有IBV。
　　 4、將PTFY株進(jìn)行新城疫病毒干擾試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)PTFY株對(duì)新城疫病毒的復(fù)制有抑制作用。
　　 5、取第5代尿囊液用氣管環(huán)培養(yǎng)物進(jìn)行病毒感染力測(cè)定,得出其TOC-ID50=10-5.413/0.1ml;將PTFY株與本實(shí)驗(yàn)室保存的

6、PT株進(jìn)行血清中和試驗(yàn),得知兩者抗原相關(guān)性低。
　　 6、參考GenBank中IBV毒株(GenBank:DQ001338.1),設(shè)計(jì)引物,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse-translation polymerase-chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增得到600bp片段產(chǎn)物,通過(guò)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)與美國(guó)呼吸型強(qiáng)毒株Mass41的同源性為97.3％,與山東腎型毒株CK/OH/LSD/03I的同源性為99％,與H52

7、的同源性為97.8％,證實(shí)PTFY株為IBV。
　　 7、用DNAstar、DNAman等分析軟件,將PTFY分離株N基因片段(345～945位)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與GenBank中14株國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行核苷酸序列比較和同源性分析,繪制出核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),得出核苷酸序列同源性、進(jìn)化樹(shù)中的分支地位與病毒親嗜性、致病力沒(méi)有必然的聯(lián)系。
　　 本試驗(yàn)從番鴨卵巢中分離到一病毒株(命名PTFY),后經(jīng)雞胚傳代、理化特性研究、電鏡