抗傳染性支氣管炎病毒S1D片段蛋白單克隆抗體的制備及特性研究.pdf

1、利用RT—PCR.技術(shù)擴(kuò)增傳染性支氣管炎病毒(IBV)J株N基因的ORF，并克隆到載體pMD18—T中。測序結(jié)果顯示其N基因全長1230bp，編碼由409氨基酸殘基組成的N蛋白。與來自Genbank的另外8株IBV比較，J株與它們的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為90％—98.8％與86.3％—97.9％。另外，將H52和J毒株稀釋后以不同體積比例同胚接種9—11日齡的SPF雞胚，并連續(xù)傳二代，應(yīng)用RT—PCR檢測兩毒株在雞胚內(nèi)可能發(fā)生

2、重組而產(chǎn)生的重組子。結(jié)果，RT—PCR在所有代次和所有比例混合接種的雞胚中均未檢測到雜交的S1基因片段和/或N基因片段。
　　 設(shè)計5條特異性引物，并在下游引物引入終止密碼子。以含有S1基因的重組質(zhì)粒pBV220—ZJ971—S、Teasy—M41—S1和pBS—J—S1為模板，通過PCR方法擴(kuò)增得到S1D片段，并將其克隆到原核表達(dá)載體pET—28a(+)中，轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)了融合6個His

3、標(biāo)簽的S1D蛋白，通過SDS—PAGE和Western blot證實(shí)了重組蛋白的表達(dá)，并證明表達(dá)產(chǎn)物可與雞抗IBV的陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 用體外表達(dá)并純化的三株不同組織嗜性(呼吸型、腎性和腺胃型)IBV S1D蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，陽性孔經(jīng)三次有限稀釋法克隆，成功獲得9株雜交瘤細(xì)胞株。其中，抗ZJ971—S1D蛋白有4株即3A8、2D12、6E2和3H6；

4、抗M41—S1D蛋白有2株即3C6、4F9；抗J—S1D蛋白有3株即4D10、4G7和6G4。9株單克隆抗體腹水間接ELISA效價為4.0×103—2.05×106(純化抗原的包被濃度為0.21μg/每孔)。除3C6和4G7的重鏈為IgG2b外，其余單克隆抗體的重鏈均為IgG1；所有單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈。蛋白印跡(Western—blot)和免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)鑒定結(jié)果表明，這些單克隆抗體能夠與同源原核表達(dá)的S1D蛋白和真核表達(dá)的

5、S1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)；間接ELISA和ICC還表明，抗IBV三個毒株S1D蛋白的單克隆抗體之間具有一定程度的交叉識別。
　　 應(yīng)用非標(biāo)記ELISA雙抗體相加實(shí)驗(yàn)，測定了9株抗S1D蛋白單克隆抗體飽和相應(yīng)抗原的最佳稀釋倍數(shù)。在此基礎(chǔ)上，測定了同源和部分異源的單克隆抗體之間的相加指數(shù)AI=23.9—98.4。把AI=50作為判定兩個單克隆抗體是否識別同一表位的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，9株單克隆抗體共識別5個不同的抗原表位，分別命名為S1—