雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法建立及非結(jié)構(gòu)蛋白nsp15單克隆抗體的制備.pdf

1、根據(jù)GenBank上400多株IBV病毒的S1基因序列設(shè)計(jì)特異性RT-PCR引物擴(kuò)增S1基因從91位堿基至303位堿基的213bp的保守區(qū)域。對(duì)該引物的PCR程序進(jìn)行引物濃度、退火溫度、延伸時(shí)間、PCR循環(huán)數(shù)等條件設(shè)置梯度進(jìn)行對(duì)比并優(yōu)化，建立RT-PCR檢測(cè)方法。建立的RT-PCR方法可以特異性檢測(cè)不同組織嗜性IBV毒株，不能檢測(cè)包括FPV、NDV、IBDV、H1N1、H9N2等在內(nèi)的其他禽類病毒核酸以及IBV自身除S基因外的部分結(jié)構(gòu)蛋

2、白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因（包括M基因、N基因、E基因、nsp2基因、nsp5基因、nsp15基因等）。靈敏性測(cè)定結(jié)果顯示，通用型RT-PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為1.5ng cDNA/μl。用建立的RT-PCR方法進(jìn)行臨床樣品的檢測(cè)，在攻毒第二天即可從IBV感染的SPF雞肛咽拭子中，以及組織病料中檢測(cè)到病毒核酸。
　　 以IBV腎型毒株SC021202為模版擴(kuò)增1014bp的IBV非結(jié)構(gòu)蛋白nsp15基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體PET-

3、28a-nsp15。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中成功表達(dá)出約45kDa的目的蛋白。表達(dá)的蛋白能與抗His的單克隆抗體反應(yīng)。純化的nsp15重組蛋白作為ELISA檢測(cè)抗原，與腎型毒株、腺胃型毒株、呼吸型毒株制備的高免血清有反應(yīng)性。純化蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，經(jīng)三次有限稀釋法克隆，獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A6、2B6和4D7。Western blot分