傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白、核蛋白基因的克隆、表達及其在抗體檢測中的初步應用.pdf

1、雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病。各種年齡、類型的雞均易感。該病呈世界分布，是嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的重大傳染病之一。傳染性支氣管炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，包含至少3種結構蛋白基因：纖突蛋白（S）基因、核蛋白（N）基因、膜蛋白（M）基因。IBV的S

2、蛋白由S1蛋白和S2蛋白兩部分組成，在病毒進化中最為活躍，是最重要的保護性抗原，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，在病毒吸附細胞過程中發(fā)揮重要作用，在血清學分類、疫苗免疫防治上起決定性作用；N蛋白進化上最為保守，主要與基因組核酸的包裹、RNA的復制和細胞免疫有關，含有大量抗原決定簇，免疫原性僅次于S蛋白，能誘導機體產(chǎn)生大量抗體。自1931年發(fā)現(xiàn)該病以來，至少已有二十九種血清型被報道，并且新的血清型和變異株仍在不斷出現(xiàn)。鑒于此，通過克隆表達具有高度

3、保守性的N蛋白基因，并其為診斷抗原建立檢測IBV抗體的ELISA法，為監(jiān)測群體的抗體水平，預防和控制該病提供可靠的依據(jù)和有效的技術保障。同時克隆、表達具有型特異性的S1蛋白基因以便為下一步研究該病的基因工程疫苗奠定基礎。本課題的主要研究內(nèi)容包括： 1、傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白S1基因和核蛋白基因的克隆與序列分析 以GenBank公布的IBv基因組的序列為依據(jù)，分別設計針對S1基因和N基因的特異性引物，通過RT-PCR法

4、從IBV基因組中擴增出完整的S1和N片斷，將擴增片斷分別克隆到pMD18-T載體，經(jīng)酶切和序列測定，S1、N基因片斷大小分別為1685bp和1230bp；用BLAST比對發(fā)現(xiàn)：S1基因與GX1-98毒株同源性為98％，N基因與H52毒株LKQ3同源性為97％。 2、傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白S1基因和核蛋白基因在大腸桿菌中的表達 構建了棄信號肽區(qū)S1基因表達載體pGEX-S1和N基因表達載體pGEX-NP，并成功進行了表

5、達，對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定，結果表明S1分子量大約為80kDa；N蛋白表達于細胞質(zhì)中，有兩種主要產(chǎn)物，大小分別為80kDa和60kDa，并利用GST親和層析柱進行了純化，獲得了相應純化產(chǎn)物，Western-blot顯示純化產(chǎn)物均能與雞IBV標準陽性血清發(fā)生特異性反應，說明有很好的免疫學活性。 3、基于重組N蛋白的IBV抗體ELISA檢測方法的建立 以純化N蛋白作為包被抗原，建立了

6、檢測傳染性支氣管炎抗體的間接ELISA方法。抗原最佳包被濃度為1.75μg／mL，待檢血清最佳稀釋度為1：80，二抗最佳工作濃度為1：6000,，以NP-ELISA分別檢測禽流感、雞新城疫、雞傳染性法氏囊、雞減蛋綜合癥標準陽性血清和標準陰性血清，結果全部為陰性，表明該方法與其它禽類病原抗體無交叉反應；重復性試驗表明批內(nèi)批間重復的吸收變異系數(shù)均小于10％。對144份雞血清同時用該方法和血凝抑制試驗（HI）進行了檢測，結果表明，特異性為60