同時(shí)檢測(cè)三種蟲媒病毒的一步三重RT-PCR酶聯(lián)雜交方法建立.pdf

1、蟲媒病毒屬于一組由媒介昆蟲攜帶，通過(guò)敏感脊椎動(dòng)物被叮咬從而得到傳播的病毒。蟲媒病毒可以引發(fā)多種人畜共患病，給我國(guó)公共衛(wèi)生和家畜養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)損失。人感染蟲媒病毒后會(huì)表現(xiàn)出多種臨床癥狀，其中以出疹和發(fā)熱最常見(jiàn)，病情嚴(yán)重者還會(huì)產(chǎn)生如腦炎、腦膜炎等癥狀危及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，甚至死亡。目前，尚沒(méi)有特效藥物治療蟲媒病毒病，主要以注射疫苗來(lái)對(duì)蟲媒病毒病進(jìn)行預(yù)防。因此，盡量避免蟲媒病毒的爆發(fā)和流行并加強(qiáng)對(duì)蟲媒病毒進(jìn)行檢測(cè)顯得的十分重要。目前，在

2、我國(guó)對(duì)大多數(shù)蟲媒病毒的檢測(cè)，仍然通過(guò)傳統(tǒng)血清學(xué)抗體檢測(cè)和細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒來(lái)進(jìn)行診斷。盡管這些方法被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，可以對(duì)蟲媒病毒進(jìn)行確診，但敏感性較低，操作周期較長(zhǎng)如細(xì)胞培養(yǎng)需要一周左右的時(shí)間，并且標(biāo)本消耗較大，難以適應(yīng)臨床和現(xiàn)場(chǎng)診斷的要求。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了多重RT-PCR聯(lián)合酶聯(lián)雜交技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)可以通過(guò)一次擴(kuò)增同時(shí)完成對(duì)三種蟲媒病毒（乙腦病毒，蓋塔病毒和塔希那病毒）的檢測(cè)。它的主要內(nèi)容為，首先比對(duì) Genbank發(fā)表的和本

3、實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的已知三種病毒基因序列，在序列高度保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并合成含有5＇端生物素的引物和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的種特異性探針。然后，采用One-Step RT-PCR Kit（QIAGEN）進(jìn)行一步法RT-PCR,通過(guò)種特異性探針識(shí)別病原PCR產(chǎn)物，加入HRP底物，通過(guò)顯色鑒定病原。本研究建立的多重 RT-PCR酶聯(lián)雜交方法檢測(cè)敏感性為JEV:1PFU/mL，GETV:10PFU/mL，TAHV:10PFU/mL。將此方法應(yīng)用于檢測(cè)