犬瘟熱病毒ELISA和RT-PCR檢測(cè)方法的研究.pdf

1、犬瘟熱（Canine Distemper）是由犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus,CDV）引起犬和肉食目中許多動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病。該病的傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，本病診斷比較困難，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法在靈敏性和特異性上存在一定局限性。另外,在犬瘟熱弱毒疫苗廣泛應(yīng)用的背景下，大多數(shù)犬的血清對(duì)犬瘟熱病毒呈陽性反應(yīng)。犬瘟熱是對(duì)實(shí)驗(yàn)用犬危害最大的病毒病之一。建立現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)質(zhì)量監(jiān)測(cè)體系基本原則是對(duì)該病必須同時(shí)包括檢測(cè)病

2、原體和檢測(cè)抗體兩個(gè)方面，本實(shí)驗(yàn)包括建立了檢測(cè)犬瘟熱病原體的RT-PCR方法和檢測(cè)抗體的ELISA方法，兩種檢測(cè)方法互相補(bǔ)充，綜合判定結(jié)果。研究工作可分為2個(gè)部分： 第一部分犬瘟熱病毒間接ELISA法檢測(cè)技術(shù)的建立與初步應(yīng)用 采用RT-PCR法擴(kuò)增出犬瘟熱病毒標(biāo)準(zhǔn)疫苗株的融合蛋白基因（F基因）片段約1499bp，核衣殼蛋白基因（N基因）片段約825bp克隆到pMD18-T載體。酶切鑒定后用一對(duì)特異性的引物擴(kuò)增約732b

3、p的F蛋白基因片段、830bp的N蛋白基因片段。這兩個(gè)基因定向克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（+）中后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，在37℃ 1.0mM IPTG誘導(dǎo)下，F(xiàn)蛋白基因、N蛋白基因片段獲得了良好表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示其表達(dá)的融合蛋白大小分別為28KDa、33KDa，與預(yù)期值相符。誘導(dǎo)條件的改變（IPTG的濃度改變）對(duì)表達(dá)量影響不大。Western印跡顯示表達(dá)產(chǎn)物能被CDV抗體特異性識(shí)別，實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果表明這兩種重組蛋白保留了天然蛋白的部分抗原性，為進(jìn)一步研究犬瘟熱病毒及其檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。利用pET-28a的 His·Tag，使目的蛋白得到較好的純化。簡(jiǎn)易的棋盤滴定法確定抗原包被濃度：F蛋白為10μg/ml，N蛋白5μg/ml，以此建立間接ELISA法。用ELISA法檢測(cè)20份樣品血清兩種蛋白的檢測(cè)結(jié)果符合率為100％。另外對(duì)血清做一系列濃度稀釋，從中得出以F蛋白為抗原，樣品血清的平均稀釋度為1：1025；以N蛋白為抗原，樣品血清

5、的平均稀釋度為1：2630。 第二部分犬瘟熱病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用 本研究通過特異性擴(kuò)增CDV核蛋白基因保守序列，建立了檢測(cè)CDV核酸的RT-PCR法。用NDV、CPV、PRV、IBV進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示該方法有較好的特異性。RT-PCR檢測(cè)的20份血樣中陽性、陰性結(jié)果與臨床試紙法檢測(cè)結(jié)果相同，而9份試紙檢測(cè)為可疑的樣品中有4份為陽性。結(jié)果表明該方法的靈敏性與特異性較高。 本研究成功地建