牛輪狀病毒RT-PCR檢測和基于VP6重組抗原檢測血清抗體ELISA方法初步建立.pdf

1、牛輪狀病毒（Brovine Rotavirus，BRV）是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員。是引起犢牛腹瀉的主要病原之一。
　　 本實驗利用牛輪狀病毒VP6基因513~916間高保守區(qū)域設計引物，從感染牛輪狀病毒細胞培養(yǎng)物和糞便樣品提取核酸，擴增到大小400bp左右的片段，經測序證明為輪狀病毒VP6片段，對擴增的敏感性測定表明，細胞培養(yǎng)物病毒含量在10-3 TCID50時，PCR擴增仍為陽性反應，該反應亦能擴增豬輪狀病毒的VP6基因

2、片段，而對豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）均不出現反應。說明本實驗建立的PCR方法對A群輪狀病毒的擴增具有高度特異性。對擴增的退火溫度測定表明，溫度范圍在40℃~60℃對擴增產物均沒有影響。這些實驗結果均說明這對引物作為診斷引物具有一定的應用價值。
　　 以牛輪狀病毒NCDV標準株擴增獲得了VP6全基因序列，將其定向插入表達載體，通過誘導表達，SDS-PAGE和Western blot分析，證明了約5

3、2kDa的目的蛋白表達。通過包涵體提取，Ni親和層析，獲得了純化的重組牛輪狀病毒VP6蛋白。對純化蛋白進一步進行Western blot分析表明，該蛋白可與全病毒抗血清發(fā)生特異性反應，為以該蛋白作為檢測抗原代替牛輪狀病毒全病毒抗原，避免培養(yǎng)病毒、純化病毒等繁瑣工藝，為抗原制備提供了廉價的方法。
　　 以牛輪狀病毒VP6蛋白作為檢測抗原，初步建立了間接ELISA進行血清抗體的檢測。本實驗重點對影響ELISA檢測的抗原包被量、包被條

4、件和封閉液種類進行了探索。
　　 采用矩陣法，通過對抗原包被濃度、包被稀釋液和不同包被條件效果的比對，最終確定了用PH8.6磷酸鹽將純化的VP6重組蛋白稀釋為0.25μg/mL加入到反應孔中，包被工作在37℃ 2.0h或4℃包被過夜。
　　 為降低ELISA反應的非特異性，本試驗對多種封閉試劑或封閉劑聯合使用進行了封閉效果對比試驗，從封閉效果看，4％ PEG20000作為封閉液，37℃封閉2h時效果最佳。
　　

5、通過條件探索，初步建立的間接ELISA方法檢測牛輪狀病毒血清抗體的最佳工作條件： pH8.6磷酸鹽緩沖液稀包被VP6蛋白，濃度為0.25μg/mL，200μl/孔，在37℃包被2.0h或在4℃包被過夜；250μl/孔，PBST洗滌3次，每次3分鐘；每孔加入200μl 4％ PEG20000作為封閉液，37℃封閉2.0h，同樣方法洗滌3次；加入1：100封閉液稀釋的被檢血清，100μl/孔，37℃作用1h，洗滌3次；加入封閉液稀釋二抗，1