豬源牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法的建立及表達BVDV保護性抗原重組豬痘病毒的構(gòu)建.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrheavirus，BVDV)與豬瘟病毒(HCV)和羊邊界病病毒(BDV)同屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員，BVDV除了能夠引起牛的病毒毒性腹瀉、粘膜病以及繁殖障礙等癥狀外，還可引起山羊、綿羊、豬、野牛、羊駝、白尾鹿等動物感染。豬主要通過與帶毒動物接觸或者使用被BVDV污染的疫苗感染BVDV，據(jù)報道豬感染BVDV可出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。由于在規(guī)?；B(yǎng)殖中混合感染日益嚴重，而且

2、牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒有著密切的聯(lián)系，因此豬源牛病毒性腹瀉病毒和豬瘟病毒的快速鑒別檢測，對于豬群的混合感染、繼發(fā)感染以及豬瘟疫苗生產(chǎn)中外源基因的檢測和豬瘟免疫失敗分析有著重要的意義。豬痘病毒(SPV)是痘病毒科，脊椎動物痘病毒亞科，豬痘病毒屬中的唯一成員，在自然情況下，SPV只感染豬，并且感染非常溫和，能自行康復(fù)。由于SPV有生物安全性和臨床安全性好、較大的插入外源基因的能力及能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生良好的保護性免疫反應(yīng)等優(yōu)點，故適合作為載體

3、用于開發(fā)重組疫苗。
　　 1.豬源牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法的建立與臨床運用根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5'端非編碼區(qū)基因序列，設(shè)計合成了一對特異性引物，經(jīng)過PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了BVDV RT-PCR的檢測方法，其PCR產(chǎn)物大小分別為186bp，對于BVDV的檢測靈敏度為10TCID50，對于CSFV、PRRSV、PEDV、SPV和PCV的PCR擴增結(jié)果均為陰性;用該方法對169份臨床樣品進行了檢測，結(jié)果BVDV有20

4、份陽性，陽性率為11.8％，其中124份糞便樣有11份陽性，22份組織樣有4份陽性，23份豬瘟細胞苗樣有5份陽性。成功測出兩份陽性樣PCR產(chǎn)物序列，并與代表毒株序列比對分析。本實驗證明建立的RT-PCR檢測方法具有快速、準確、低污染等優(yōu)點，可用于臨床樣品中BVDV的檢測。
　　 2.表達BVDV保護性抗原重組豬痘病毒的研制E2是BVDV囊膜糖蛋白含有病毒的主要抗原決定簇，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)，是BVDV的主要保護性抗原。

5、本研究以BVDV標準毒株Oregon c24v基因組為模板擴增出E2基因，將E2基因連接到通用克隆載體pUSG11/P28上，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體pUSG11/P28E2，利用SPV020和SPV021兩基因間的非編碼區(qū)作為產(chǎn)生重組豬痘病毒外源基因的插入位點，GFP基因作為一個顯性篩選標記，獲得的重組病毒rSPV-E2。通過PCR、western blotting和間接免疫熒光檢測對rSPV-E2進行了鑒定，結(jié)果顯示rSPV-E2能正確表達E