牛病毒性腹瀉病毒重組E2蛋白多克隆抗體制備及間接ELISA方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、牛病毒性腹瀉/粘膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起，可引起牛群臨床和病理學癥狀，表現(xiàn)為繁殖障礙、胎兒畸形及廣泛的免疫抑制，導致牛群生產(chǎn)力低下和嚴重的粘膜病，從而造成世界范圍養(yǎng)牛業(yè)的重大損失。牛病毒性腹瀉病毒基因組編碼11種蛋白，其中E2蛋白是病毒主要的保護性抗原，能誘導中和抗體的產(chǎn)生，保護實驗動物不受同源毒株的攻擊。利用已有的表達BVDVE2

2、蛋白的重組質(zhì)粒pET30a-E2轉(zhuǎn)化表達菌BL21（DE3），經(jīng)培養(yǎng)誘導表達出重組E2蛋白，Westernblot顯示純化的重組E2蛋白能夠與BVDV陽性血清反應(yīng)。用純化的重組E2蛋白免疫新西蘭白兔制備了多克隆抗體，病毒中和試驗測定其中和抗體效價為1:2048。間接免疫熒光和免疫印跡試驗證實了其具有良好的反應(yīng)性。間接免疫熒光試驗證明其在1:1280倍稀釋時仍具有較高的活性。本研究所制備的BVDV重組E2蛋白兔源多克隆抗體可應(yīng)用于國內(nèi)BV

3、DV的檢測，同時為進一步建立檢測BVDVE2蛋白的ELISA奠定了基礎(chǔ)。
　　 將純化后的BVDVE2蛋白作為包被抗原建立了檢測牛病毒性腹瀉病毒抗體的間接ELISA，將其命名為E2-ELISA。通過一系列試驗，確定了重組抗原最佳包被濃度（12.8μg/ml）；最佳封閉液（1％明膠）和最佳封閉時間（60min）；血清樣本最佳稀釋度（1:160）和最佳作用時間（60min）；酶標二抗最佳工作濃度（1:5000）和最佳作用時間（60m

4、in）；底物最佳顯色時間（10min）；判定臨界值（OD>10.364者判為陽性，OD<0.364者判為陰性）。交叉反應(yīng)試驗表明，該重組抗原與其它常見6種牛病的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。阻斷試驗表明，BVDV細胞培養(yǎng)液能在很大程度上阻斷重組抗原與陽性血清的反應(yīng)，而對陰性血清沒有明顯的影響。重復(fù)性試驗表明，批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)小于10％，批間重復(fù)的變異系數(shù)小于10％。與病毒中和試驗相比，符合率、特異性和敏感性分別為86.3％、82.6％和87

5、.7％。與瑞典進口全病毒ELISA診斷試劑盒相比，符合率、特異性和敏感性分別為87.5％、85％和88.3％。應(yīng)用BVDVE2-ELISA檢測了黑龍江省內(nèi)的852份牛血清樣本，其抗體陽性率為74.18％（632/852）。上述結(jié)果表明，BVDVE2-ELISA診斷方法具有較好的敏感性和特異性，顯示出了良好的應(yīng)用前景。
　　 本研究成功表達了BVDVE2基因，獲得了以包涵體形式表達的重組E2蛋白，制備了具有高病毒中和活性和特異性的