牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR方法的建立與gP48基因克隆及原核表達.pdf

1、牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD),是由牛病毒性腹瀉病毒引起的一種發(fā)熱、粘膜糜爛、潰瘍、腹瀉、白細(xì)胞減少、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的傳染病。由于其能引起母牛繁殖系統(tǒng)障礙并能形成持續(xù)性感染,因而對養(yǎng)牛業(yè)有著重要的影響。
　　 本試驗用MDBK細(xì)胞增殖BVDVOregonC24V,在細(xì)胞出現(xiàn)80％病變時,收獲細(xì)胞病毒培養(yǎng)液。對標(biāo)準(zhǔn)毒株OregonC24V進行TCID50的測定,測得TCID50為105.52。依據(jù)

2、GenBank中已發(fā)表的OregonC24V(AF091605),NADL(M3118),ZM95(AF526381),Singer(DQ088995)等13株BVDV全基因序列進行比對,使用Primer5.0軟件設(shè)計一對擴增引物,在擴增標(biāo)準(zhǔn)毒株OregonC24V得到了大小為330bp的片段,與預(yù)期設(shè)想一致。對CSFV,IBRV,BRV,PRV,PRRSV,MDBK細(xì)胞進行RT-PCR擴增,都未擴增出片段,表明此方法具有較高的特異性。

3、對BVDV的TCID50倍比稀釋后進行檢測,稀釋106倍仍能檢測到病毒,表明此方法具有較高的敏感性。對臨床采集的70份犢牛腹瀉的糞便樣品進行檢測,有17份檢測為陽性,陽性率為24.28%。表明此方法可用于BVDV實驗室檢測。以上結(jié)果證明該方法具有較高的實用價值,可為BVDV的實驗室快速診斷提供一個有效的方法。
　　 本試驗依據(jù)GenBank中已發(fā)表的BVDV全基因序列進行比對,使用Primer5.0軟件針對gP48全基因設(shè)計一對

4、擴增引物,應(yīng)用RT-PCR擴增技術(shù)對BVDVC24V株進行擴增并進行克隆及酶切鑒定,構(gòu)建了pMD18-T-gP48載體。將克隆載體進行測序,經(jīng)序列對比與發(fā)表序列一致,表明成功構(gòu)建了pMD18-T-gP48載體。試驗將gP48基因插入到pET32a(+)質(zhì)粒,構(gòu)建了原核表達載體。將構(gòu)建好的原核表達載體進行酶切鑒定。SDS-PAGE進行檢測分析,在46kDa左右處有蛋白條帶。將表達蛋白純化后進行Western-Blotting分析,在46k