牛病毒性腹瀉病毒寧夏地方分離株的分離及其E0基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、牛病毒性腹瀉/黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒(BVDV)引發(fā)的牛的一種傳染病。該病主要發(fā)生于牛，犢牛更易感，還可感染其它動(dòng)物，主要引起牛腹瀉，急、慢性粘膜病，持續(xù)性感染與免疫耐受，母畜流產(chǎn)和死胎等，給養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重的損失。為了調(diào)查寧夏地區(qū)牛病毒性腹瀉/粘膜病的流行病學(xué)及分子流行病學(xué)情況，掌握該病在寧夏地區(qū)的流行狀況，本試驗(yàn)運(yùn)用ELISA

2、方法對寧夏BVDV的感染及流行情況進(jìn)行調(diào)查。并在此基礎(chǔ)上對血清學(xué)陽性牛進(jìn)行分子生物學(xué)跟蹤檢測，以獲得BVDV地方分離株。
　　本研究對送到實(shí)驗(yàn)室檢測的326份血清樣品和278份耳組織樣品，運(yùn)用BVDV抗體ELISA檢測試劑盒對血清樣品進(jìn)行抗體檢測，對耳組織樣品使用BVDV抗原ELISA檢測試劑盒進(jìn)行抗原檢測。對送檢樣品BVDV血清學(xué)的研究。檢測結(jié)果顯示，326份血清樣品的BVDV抗體陽性率為90.2％，278份耳組織樣品的BVDV

3、抗原陽性率為0.3％。檢測結(jié)果表明寧夏地區(qū)送檢的樣品中BVDV抗體陽性率很高，可能是因?yàn)樗蜋z的都是具有腹瀉、流產(chǎn)等癥狀的樣品有關(guān)。
　　利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對診斷出的抗原陽牛進(jìn)行病毒分離，并順利獲得牛病毒性腹瀉病毒分離株，命名為BVDV-NX。該分離株在MDBK細(xì)胞系上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，出現(xiàn)空斑、拉網(wǎng)和脫落等一系列典型的細(xì)胞病變(CPE)。隨后收集病毒液，提取病毒總RNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得BVDV-NX毒株cDNA。利用PCR方法對5’-UT

4、R基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序，應(yīng)用MEGA6分析軟件，選擇N-J(Neighbor-Joining)方法繪制遺傳進(jìn)化樹，這株BVDV-NX屬于BVDV基因1b型。
　　根據(jù)NCBI上已發(fā)表的BVDV-E0基因序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，利用PCR方法擴(kuò)增出710bp的E0基因，進(jìn)行測序及序列分析。將PCR擴(kuò)增的E0基因克隆入原核表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行雙酶切鑒定，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-E0，為