牛病毒性腹瀉病毒陜西株的分離與NS-,5B-基因序列測定.pdf

1、牛病毒性腹瀉-黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一種以發(fā)熱、腸粘膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、咳嗽、持續(xù)性感染與免疫耐受及懷孕母牛流產或產出畸形胎兒為主要特征的，復雜的，呈多種臨床類型的傳染病，對養(yǎng)牛業(yè)危害非常大，是世界各國重點防制和檢疫的對象。BVD-MD主要感染牛、羊、

2、鹿、豬等。此病的分布幾乎遍布全世界，我國自1980年首次報道該病以來，已有20多個省份相繼報道有本病的發(fā)生。1994年陳茂盛等對陜西省13個縣的肉牛、奶牛BVDV的感染情況做了血清學調查，結果發(fā)現(xiàn)陽性率為12.7％。近年來該病在陜西牛群中的流行有擴大的趨勢，但至今未見BVDV陜西分離株的相關研究報道。2007年陜西某規(guī)?；膛龆囝^犢牛發(fā)生頑固性腹瀉，疑為BVDV或輪狀病毒(Rotavirus，RV)感染所致，筆者隨即采集病死犢牛的腸系

3、淋巴結，對病原進行了分離鑒定。參考NS5B基因保守序列設計1對引物：P1:5'-TGG AGA TCT TTC ACA CAA TAG C-3'：P2:5’-GCT GTT TCA CCC AGT TATACA T-3'，用于BVDV NS5b基因的擴增；另外參照RV的VP1基因保守序列設計1對引物，P3:5'-AGAATTTCC GTT TGG CTA-3'；P4:5’-CGGTCACATCATACAACT CT-3'，用于RV VP

4、1基因擴增。取發(fā)病犢牛的腸系淋巴結，進行研磨處理后，取上清液，按Invitrogen公司的TRIZOL LS@ Reagent試劑盒操作說明書提取病毒基因組RNA，進行RT-PCR擴增。結果擴增到約360bp的BVDVNS5B基因，未擴增到RVVP1基因，初步鑒定為牛病毒性腹瀉-黏膜病。取病料上清液接種于MDBK細胞，盲傳4代后出現(xiàn)典型、規(guī)律的細胞病變。采用病毒蝕斑技術對病毒進行克隆純化，提取其基因組RNA，再次進行RT-PCR鑒定。用

5、Gel Extraction Mini Kit W5212純化回收RT-PCR產物，將擴增的NS5B基因片段與pMD18-T載體連接構建重組質粒，將重組質粒轉化DH5α感受態(tài)細胞，采用堿裂解法小量提取質粒，并對質粒進行酶切鑒定(EcoR I和Sal I雙酶切及Sal I單酶切)和PCR鑒定。將陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司和上海捷瑞生物工程有限公司分別測序后進行序列分析。結果顯示，分離毒株為致細胞病變型(CP型)BVDV，與