表達(dá)牛病毒性腹瀉病毒E2基因重組Ⅰ型牛皰疹病毒活疫苗的免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、牛病毒性腹瀉病(Bovine Viral Diarrhea，BVD)為牛病毒性腹瀉病毒毒(Bovine ViralDiarrhea Virus，BVDV)感染而致牛及其他動(dòng)物以病毒性腹瀉-粘膜病、繁殖障礙等為主要臨床特征的傳染性疾病。牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)是由牛皰疹病毒Ⅰ型（Bovine Herpes virus-1，BHV-1）引起牛以呼吸道疾病和生殖道疾病為主要

2、臨床特征的傳染性疾病。目前，這兩種傳染病均在世界范圍內(nèi)流行，可引起奶牛產(chǎn)奶量下降，懷孕母牛流產(chǎn)、胎兒免疫耐受、疫苗免疫失敗，持續(xù)性感染和動(dòng)物發(fā)病死亡，對(duì)全球奶牛業(yè)和肉牛業(yè)均造成了嚴(yán)重的影響，保守估計(jì)損失每年達(dá)數(shù)十億美金。通過對(duì)國(guó)內(nèi)牛群血清學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，BVDV（包含1型與2型）和BHV-1已在國(guó)內(nèi)開始廣泛的流行，目前國(guó)內(nèi)還沒有標(biāo)準(zhǔn)化的疫苗，因此研制相應(yīng)的高效疫苗迫在眉睫。
　　基于國(guó)外使用多年的BHV-1（Colorado-1株

3、）弱毒疫苗為載體，國(guó)內(nèi)流行的1型與2型BVDV的重要免疫原E2編碼基因的克隆、表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)1型與2型BVDV E2基因的重組BHV-1活疫苗，通過牛體臨床動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證該多價(jià)活疫苗體內(nèi)免疫效力，為后期疫苗臨床推廣奠定基礎(chǔ)，研究?jī)?nèi)容如下:
　　研究一:基于構(gòu)建表達(dá)BVDV-1 E2基因的重組BHV-1重組病毒(v31B)和構(gòu)建共表達(dá)BVDV-1和BVDV-2 E2基因的重組BHV-1病毒(L1F)基礎(chǔ)上，在MDBK細(xì)胞上增殖重組病毒

4、v31B和L1F。應(yīng)用RT-PCR方法驗(yàn)證了BVDV E2基因存在于重組病毒基因組中，并且能夠在MDBK細(xì)胞上傳代后穩(wěn)定存在。應(yīng)用Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)驗(yàn)證了BVDV-1和BVDV-2 E2基因在重組BHV-1病毒感染的細(xì)胞中獲得了表達(dá)， v31B和L1F病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)分別為106.6 TCID50/mL和1080 TCID50/mL。
　　研究二:將測(cè)試并篩選14頭BVDV和BH

5、V-1抗原、抗體均呈陰性的6-8月齡牛，隨機(jī)分為五組，除對(duì)照組兩頭外，其余4組每組三頭，采用頸部肌肉注射接種方式，第一、二組接種重組病毒v31B，劑量分別為2mL/頭、4mL/頭，第三、四組接種重組病毒L1F，劑量分別為2mL/頭、4mL/頭，對(duì)照組注射DMEM培養(yǎng)基2mL，首免后第4周以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次，每次免疫后的連續(xù)兩周監(jiān)測(cè)牛的臨床癥狀，測(cè)量牛的直腸溫度。在設(shè)定的時(shí)間節(jié)點(diǎn)計(jì)數(shù)其白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，每周檢測(cè)其BVDV和BHV-1抗

6、體。首免后第13周，選取重組病毒v31B免疫組兩頭牛頸部肌肉接種BVDV-1(NADL株)強(qiáng)毒株，重組病毒L1F免疫組兩頭牛，一頭牛接種BVDV-1(NADL)強(qiáng)毒株，另一頭牛接種BVDV-2(XJ-04)強(qiáng)毒株，對(duì)照組兩頭牛分別感染NADL和XJ-04，接種量都為3mL。監(jiān)測(cè)臨床癥狀，測(cè)量牛的直腸溫度，計(jì)數(shù)其白細(xì)胞，檢測(cè)有無BVDV病毒血癥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第一次免疫后牛群會(huì)出現(xiàn)一過性程度較輕的應(yīng)激，但未出現(xiàn)臨床癥狀，第二次加強(qiáng)免疫無