表達牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白重組干酪乳桿菌的構建、免疫原性評價及其抗原捕獲ELISA方法的建立.pdf

1、牛病毒性腹瀉(BVD)由是牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的能嚴重影響牛群的健康狀態(tài)和生產情況,可引起持續(xù)的經濟損失,是全球最重要的牛傳染病之一。BVDV為黃病毒科瘟病毒屬成員,其致病機制獨特且能引起免疫抑制,常導致該病防控失敗。正確的免疫程序、準確的檢測方法和清除持續(xù)感染動物等措施對于持續(xù)有效地防控該病十分重要。本研究構建了表達BVDV E2蛋白的重組干酪乳桿菌（L.casei）

2、評估了其免疫原性,研究了干酪乳桿菌的抑制病毒增殖能力,同時還建立檢測BVDV抗原的ELISA方法,為該病的預防與控制提供技術支持。
　　1、表達BVDV囊膜糖蛋白E2重組干酪乳酸桿菌（L.casei/pELX1-E2）的構建和免疫原性評價
　　1.1、重組干酪乳酸桿菌（L.casei/pELX1-E2）的構建
　　BVDVE2蛋白可以誘導機體產生高水平的中和抗體,同時L.casei在腹瀉病的防控中被廣泛使用,常被用作異

3、源基因表達載體。本研究首先通過RT-PCR擴增BVDV(NADL-AV67)的E2基因,將其克隆至pELX1載體,構建重組載體pELX1-E2。將構建好的重組載體轉入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,通過SDS-PAGE和Western blot(WB)驗證E2蛋白的表達。將重組載體pELX1-E2電轉到L.casei感受態(tài)細胞中,得到重組菌株L.casei/pELX1-E2。通過SDS-PAGE和WB證實重組L.casei/pELX1-E

4、2能成功表達E2蛋白。表達產物大小約為40kDa,且當菌液OD600值達到1.5時表達量最高。通過間接免疫熒光(IFA)試驗證實E2蛋白表達于重組細菌的表面。
　　1.2、用BALB/c小鼠評估疫苗株免疫原性。
　　將小鼠隨機分成5組,其中3組分別通過口服、鼻內和肌內注射等途徑免疫等量的(1010CFU/mL)重組干酪乳桿菌（L.casei/pELX1-E2）,另外2組分別口服含空質粒的干酪乳桿菌(L.casei/pELX1

5、)和無菌PBS。兩周后加強免疫,共免疫三次。在免疫后0、14、28、42天,尾靜脈采血,檢測IgG、IFN-γ和IL-12水平,收集糞便檢測sIgA水平以評估黏膜免疫水平。使用105TCID50劑量的BVDV-1株攻擊免疫鼠以評估疫苗的保護效力。與肌肉注射L.casei/pELX1-E2相比,口服或者鼻內注射L.casei/pELX1-E2能顯著(P＜0.01)提高黏膜sIgA、血清IgG、IFN-γ和IL-12水平,其中鼻內接種免疫效

6、果最好。中和試驗結果顯示,該疫苗株能產生針對BVDV的中和抗體,效價為1∶128。由此可見,L.casei/pELX1-E2可以作為一種安全、有效的預防BVD的候選疫苗。
　　2、L.caseiMCJ蛋白質代謝物(LPM)抑制BVDV-1感染MDBK細胞的研究。
　　乳酸桿菌被廣泛應用于人和動物胃腸疾病的預防和治療。本試驗使用MDBK細胞模型,研究LPM體外抗BVDV的作用。首先從L.casei培養(yǎng)液中提取其安全性和活性好的

7、LPM;其次,測定了LPM對細胞的毒性,當LMP濃度達到3000μg/ml細胞活性仍高于80％,說明LPM的細胞毒性較小?？瞻咴囼灲Y果證明LPM可以有效抑制BVDV感染。為了研究LPM的抗病毒機制,分別在BVDV-1病毒感染前、感染時和感染后用LPM處理MDBK細胞。間接免疫熒光試驗、定量RT-PCR和WB結果顯示,經LPM處理后BVDV感染細胞的數(shù)量、病毒的拷貝數(shù)以及BVDV E2蛋白的表達量顯著減少,在三種處理中,在BVDV感染的同

8、時加入LPM抑制效果最好。本研究證明LPM具有潛在的抗BVDV作用。
　　3、BVDV抗原檢測夾心ELISA方法的建立
　　3.1、重組蛋白的表達、單克隆抗體和多克隆抗體的制備。
　　首先將BVDV的NS3和E2基因分別克隆到pET-30a(+),使用原核表達系統(tǒng)表達NS3和E2蛋白。將純化的E2蛋白免疫四周齡BALB/c小鼠（n=5）。間接ELISA結果顯示雜交瘤細胞（IB-10）產生的抗體可識別與E2蛋白和BVDV

9、-1抗原,其效價為1∶12800。純化用雜交瘤細胞免疫小鼠的腹水,獲得E2蛋白的單克隆抗體。使用純化的NS3蛋白免疫10周齡新西蘭白兔制備針對NS3蛋白的多克隆抗體(PAb)。采用間接ELISA、WB和IFA試驗鑒定MAb和PAb。
　　3.2、抗原捕獲ELISA反應條件的優(yōu)化。
　　使用棋盤滴定法確定能產生最高P/N值的反應條件。以兔抗NS3多克隆抗體為捕獲抗體、鼠抗E2單克隆抗體為檢測抗體。檢測了25份BVDV陰性白細胞

10、樣品,根據平均OD值確定該方法的判定標準是OD值0.523。該ELISA可檢測最低濃度為50ng/mL的BVDV蛋白的和103TCID50的病毒量。批間和批內變異系數(shù)分別為3.87％和6.90％。本AC-ELISA方法可以有效區(qū)分BVDV與引起牛和豬腹瀉的其他病原,無假陽性結果。
　　3.3、模擬陽性樣品的檢測。
　　將BVDV人為加入白細胞樣品、皮膚和肺樣品中,用本方法、TaqMan qRT-PCR和傳統(tǒng)RT-PCR同時檢

11、測計算Kappa值。本方法與這兩種方法之間的Kappa值為0.86,1.0;0.86,0.72和0.72,0.85,檢測結果具有高度一致性。表明一種敏感性和特異性較好的BVDV-1的抗原捕獲ELISA方法已經建立,但還需要進一步的臨床評價。
　　結論:本研究用小鼠模型評估了表達BVDV E2蛋白的重組干酪乳桿菌的免疫原性,結果表明該重組菌有成為新的抗BVDV疫苗的潛力;發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌在體外具有抗BVDV的活性,表明干酪乳桿菌在預防