鴨病毒性腸炎病毒gB基因主要抗原區(qū)域原核表達(dá)及其ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、鴨病毒性腸炎(Duck virus enteritis，DVE)，俗稱鴨瘟(Duck plague，DP)，是鴨、鵝、大雁等多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，由鴨病毒性腸炎病毒(Duckenteritis virus，DEV)引起。病毒基因組編碼十幾種糖蛋白，其中g(shù)B蛋白是病毒囊膜表面展示的主要蛋白之一，也是主要的免疫原蛋白。本試驗(yàn)使用雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)鴨病毒性腸炎病毒，提純病毒后提取病毒DNA作模板。根據(jù)GenBank獲取

2、DEV基因序列(登錄號(hào)EF203709)，利用生物學(xué)軟件DNAstar分析DEV gB蛋白氨基酸序列，篩選出其抗原性高、水溶性和表面展示概率高的2個(gè)區(qū)域(分別命名為gBa Asp113～Ala478: gBb Thr218～Val584)，PCR擴(kuò)增出這兩段主要抗原區(qū)域并且克隆進(jìn)入載體pMD18-T Vector，目的基因經(jīng)PCR酶切鑒定后連接至原核表達(dá)載體pET-32a(+)。獲得的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E coliBL21(DE3)感受態(tài)

3、細(xì)胞，SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體的形式高效表達(dá)，Westem-blotting分析及重組蛋白免疫小鼠實(shí)驗(yàn)中血清抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性，具有DEV診斷抗原及亞單位疫苗的應(yīng)用前景。 表達(dá)重組蛋白pET-32a-gBa經(jīng)過初步純化之后用作包被抗原，建立了針對(duì)DEV血清抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。并且確定了最適抗原包被濃度為2.5μg/mL、最適血清稀釋度為1:800、血清

4、最適作用時(shí)間90min、最佳封閉條件為0.15％的BSA4℃封閉24h、酶標(biāo)抗體最適稀釋度為1:1000，最適作用時(shí)間為30min，底物最適顯色時(shí)間為37℃5min，判定標(biāo)準(zhǔn)為OD450≥0.446為陽(yáng)性。應(yīng)用該間接ELISA方法檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室保存的DEV陽(yáng)性血清。結(jié)果表明該診斷方法具有良好的特異性及敏感性，顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究成功克隆表達(dá)了DEV gB基因的主要抗原區(qū)域，獲得了可溶性表達(dá)的目的蛋白，為研究gB基因的功能