鴨腸炎病毒的提純和間接ELISA診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、鴨病毒性腸炎(Duckviralenteritis，DVE)又名鴨瘟(Duckplague，DP)，是由鴨腸炎病毒(Duckenteritisvirus，DEV)引起的鴨、鵝、天鵝及其它雁形目禽類(lèi)的一種急性、熱性、接觸性的傳染病，其特征是流行廣泛、傳播迅速、發(fā)病率和死亡率高。當(dāng)前迫切需要建立可靠的檢測(cè)手段，以便能正確地了解鴨群的健康狀態(tài)和免疫抗體水平。 本試驗(yàn)將DEV雞胚化弱毒AV1222株通過(guò)雞胚成纖維細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒經(jīng)反復(fù)凍

2、融、差速離心收集病毒沉淀。將其等量分成三份，分別用蔗糖不連續(xù)密度梯度離心法、酒石酸鉀不連續(xù)密度梯度離心法、氯化銫不連續(xù)密度梯度離心法三種純化方法提純。通過(guò)對(duì)三種純化方法提純的病毒進(jìn)行電鏡觀察、濃度測(cè)定及ELISA抗原性檢測(cè)，確定蔗糖不連續(xù)密度梯度離心法提純的病毒純度和濃度都高、ELISA抗原性好，是DEV較為理想的純化方法。蔗糖密度梯度離心后的30％-40％、40％-50％、50％-60％三層收集的病毒經(jīng)SDS-PAGE電泳，三層病毒條

3、帶清晰，Western-Blot檢測(cè)結(jié)果表明：30％-40％、40％-50％層收集的病毒能夠與DVE陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合，確定以這兩層病毒作為ELISA的包被抗原。 以經(jīng)蔗糖梯度純化的DEV包被酶聯(lián)板，建立了鴨病毒性腸炎間接ELISA診斷方法。通過(guò)方陣試驗(yàn)確定了包被抗原的濃度為3.64μg/mL，血清稀釋度為1∶100；通過(guò)檢測(cè)190份陰性血清確定了ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)，S/P≥0.125判為陽(yáng)性，S/P＜0.100判為陰性。

4、阻斷試驗(yàn)表明，細(xì)胞毒能在49.32％的程度上阻斷與陽(yáng)性血清的反應(yīng)，對(duì)陰性血清沒(méi)有明顯影響。交叉試驗(yàn)表明：包被抗原與鴨其它7種疾病的陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。本診斷方法與血清中和試驗(yàn)相比較，符合率為100％：與本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的DEVUL19重組蛋白間接ELISA診斷方法相比較，符合率為95.35％。批內(nèi)變異系數(shù)為2.20％-8.40％，批間變異系數(shù)為1.61％-8.26％，均小于10％。上述結(jié)果表明本診斷方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)

5、性。應(yīng)用本診斷方法對(duì)免疫鴨的特異性抗體水平進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，免疫后第7天就已經(jīng)產(chǎn)生抗DEV特異性抗體，28天抗體達(dá)到峰值；對(duì)免疫攻毒鴨抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，抗體在攻毒后第2周時(shí)達(dá)到峰值，攻毒后第13周仍維持較高的抗體水平。對(duì)哈爾濱、齊齊哈爾、大慶送檢的507份血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為35.1％，顯示出良好的應(yīng)用前景。 本研究以提純的鴨腸炎病毒作為包被抗原建立了間接ELISA診斷方法，本診斷方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為開(kāi)