廣西鴨坦布蘇病毒分離鑒定、全序列分析與間接ELISA方法的建立.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病是近年影響我國養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一，引起該病的病原為鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus，DTMUV)。該病主要引起種鴨和蛋鴨產蛋量大幅下降甚至停產，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大經濟損失。本研究開展了近年該病在廣西發(fā)生的臨床病例的診斷及其病原的相關研究。具體研究內容和結果如下:
　　一、DTMUV的分離鑒定、全基因組測定和遺傳變異分析
　　本研究對2012-2015年廣西地區(qū)疑似發(fā)生DTMUV感染的臨床

2、病例進行RT-PCR快速診斷，并對陽性臨床樣品進行病毒分離鑒定，成功分離到四株DTMUV，分別命名為GX120915、GX130330、GX150829、GX151002。對4個DTMUV分離株用BHK-21細胞進行噬斑純化，獲得四株含單一病毒的DTMUV。將純化的分離株進行全基因組序列測定、遺傳變異分析、分子生物學特性研究、毒力測定以及動物回歸試驗。結果發(fā)現，GX120915、GX130330、GX150829、GX151002的基因

3、組全長分別為10991bp、10991bp、10990bp、10992bp，僅含一個大的閱讀框，編碼3425個氨基酸的多聚蛋白，兩側各有一個非編碼區(qū)。與NCBI公布的51株TMUV核苷酸同源性高于96％，氨基酸的同源性高于98％。GX150829分離株與其他地區(qū)分離株親緣關系更近，屬同一分支;GX120915、GX130330、GX151002與廣西分離株GX2013G、GX2013H和重慶分離株CQW1的親緣關系最近，形成了一個小分支

4、，具有地方特色，這與E基因、NS5基因構建的遺傳進化樹結構相一致。分離株均無血凝活性。分離株的鴨胚半數致死量(ELD50)為10-4.32～10-4.68/0.2mL。動物回歸試驗結果表明，GX120915、GX130330、GX10829、GX151002對7天齡靖西麻鴨有較強的致病力，發(fā)病率為60％～80％，死亡率為20％～40％，四株分離株人工感染靖西麻鴨的臨床發(fā)病特征與自然感染病例相似。
　　二、DTMUV E蛋白主要抗原

5、區(qū)域的原核表達與鑒定
　　根據GX120915株結構蛋白E基因序列，設計合成一對特異性引物，RT-PCR擴增1194 bp E基因片段克隆至pMD18-T載體中，測序及酶切鑒定正確后，將目的基因定向克隆至pET-32a表達載體中，測序及酶切鑒定正確后，轉化大腸桿菌BL21，經IPTG誘導獲得目的蛋白，同時利用鎳離子親和層析柱對目的蛋白進行純化，不同濃度尿素進行復性，SDS-PAGE電泳和Western blot結果顯示目的蛋白大小

6、約為53 kDa，與預期一致，表明目的蛋白得到表達，且具有良好的免疫原性。
　　三、DTMUV E蛋白間接ELISA方法的建立
　　將表達具有良好免疫原性的E蛋白作為包被抗原，建立檢測DTMUV抗體的間接ELISA方法，經過優(yōu)化條件后，確定判定陰陽性的臨界值為0.354。用建立的ELISA方法檢測常見鴨源病毒病的陽性血清，檢測結果均低于臨界值，表明其特異性強;批內和批間重復試驗的平均變異系數都小于10％，說明其穩(wěn)定性好;敏感