鴨坦布蘇病毒病安徽株AH-F10的分離鑒定及防控技術研究.pdf

1、2009年以來，安徽省及周邊省市規(guī)模鴨場流行以種鴨和蛋鴨產(chǎn)蛋驟降并伴發(fā)死亡的疾病，疫情傳播速度快，波及面廣，對規(guī)模化種鴨場、蛋鴨場造成嚴重經(jīng)濟損失，安徽省宣城、安慶、池州、銅陵、巢湖、合肥、淮南、六安等主要養(yǎng)鴨地區(qū)疫情尤為嚴重。疫情發(fā)生時，鴨群的采食量迅速下降，隨后產(chǎn)蛋率急劇下降、甚至停產(chǎn)并出現(xiàn)不同程度死亡。不同地區(qū)、不同品種的種鴨和蛋鴨群發(fā)病率20％～30％，鴨群群內(nèi)發(fā)病率高達100％，病死率約為5％～10％。后備種鴨和蛋鴨發(fā)病導致開

2、產(chǎn)推遲，產(chǎn)蛋率低;產(chǎn)蛋期鴨群在經(jīng)過3～5周的產(chǎn)蛋下降后，產(chǎn)蛋恢復過程非常緩慢，難以達到高峰。本研究從2010年起，深入疫區(qū)規(guī)模鴨場廣泛收集流行病學數(shù)據(jù)，采集臨床病鴨組織和血清樣品進行檢測，證明該病原是鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)是一種新發(fā)減蛋-死亡綜合征的鴨傳染病。本文在流行病學調查、臨床學、病理學和免疫學研究的基礎上，利用分離鑒定的DTMUV安徽分離株AH-F1O建立了DTMUV的分子生物學診斷方法

3、和抗原抗體瓊擴試驗，研制了滅活疫苗和高免卵黃抗體，初步建立了安徽規(guī)模鴨場鴨坦布蘇病毒病防治技術，并在部分規(guī)模鴨場中試應用，有效地控制了安徽減蛋-死亡綜合征（鴨坦布蘇病毒?。┞雍土餍小?br>　　1、規(guī)模鴨場鴨坦布蘇病毒病流行病學調查為全面了解我省規(guī)模鴨場鴨坦布蘇病毒流行情況，對全省9個市、24個縣的74個規(guī)模鴨場（戶）的蛋鴨減蛋-死亡綜合征發(fā)病情況進行了流行病學調查、臨床和實驗室診斷。結果表明，安徽省規(guī)模鴨場（戶）的蛋鴨減蛋-死亡綜合

4、征的主要病原為鴨坦布蘇病毒(DTMUV)，群體總發(fā)病率10.5％，病死率7.24％，產(chǎn)蛋率下降42.5％。用PCR方法對收集的527份病料檢測，結果鴨坦布蘇病毒核酸陽性504份，陽性檢出率95.6％。分析結果表明，DTMUV感染、飼養(yǎng)管理條件差和環(huán)境氣候多變等是蛋鴨減蛋-死亡綜合征多發(fā)的重要誘因。
　　2、鴨坦布蘇病毒安徽AH-F10株的分離鑒定本試驗從安徽規(guī)模鴨場臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋突然降低的鴨群，無菌采集肝、脾、胰腺、卵泡、輸卵管、

5、卵巢、血液、淋巴結、和腎臟等病料，分別接種10日齡SPF雞胚進行病原分離，經(jīng)SPF傳代、PCR鑒定和基因序列分析等鑒定，結果獲得1株DTMUV。對分離到的病毒命名為安徽AH-F10，致病性試驗和特性檢測結果表明，該株病毒對雞胚的半數(shù)致死量(ELD50)為10-267/0.2mL，鴨胚的半數(shù)致死量(ELD50)為103.05/0.2mL，該病毒在pH7.2的條件下不能凝集鴨、雞的紅細胞，不能在雞胚成纖維細胞生長，但能在鴨胚成纖維細胞生長。

6、RT-PCR擴增和序列分析結果證明，該病毒與中國各地引起鴨產(chǎn)蛋下降綜合征的新型鴨坦布蘇病毒的同源性達到96-99％。
　　3、安徽AH-F1O株DTMUV的致病性研究為進一步弄清DTMUV的致病性，本研究對安徽分離株AH-F10進行動物致病性試驗。結果表明，用每只103.05個ELD50的AH-F10病毒頸部肌肉注射28周齡高產(chǎn)蛋鴨，鴨呈現(xiàn)采食量下降，隨后產(chǎn)蛋量下降并逐漸停止，而未攻毒對照組鴨表現(xiàn)正常。病理檢測發(fā)現(xiàn)，攻毒鴨可見明顯

7、的卵巢變性、變形和萎縮，而對照組鴨表現(xiàn)正常，剖檢無明顯病變。用同樣劑量攻擊雛鴨，結果雛鴨出現(xiàn)精神不振，蜷縮，流涎，減食，糞便稀薄，呈綠色水樣便，嚴重的雙腿向后伸張，站立不起，解剖見腦膜出血，肝臟出血腫大，胰腺有出血，腸道腫大。這些結果表明，本研究分離到的DTMUV安徽分離株AH-F10不僅對產(chǎn)蛋鴨致病，而且對雛鴨有明顯的致病作用，并能夠引起雛鴨死亡。
　　4、瓊脂擴散試驗檢測鴨坦布蘇病毒及抗體方法的建立本研究用濃縮DTMUV安徽A

8、H-F10株抗原免疫新西蘭大白兔，制備抗鴨坦布蘇病毒高免血清，以濃縮的病毒與抗鴨坦布蘇病毒血清抗體進行瓊脂擴散試驗。結果表明，以1/15M pH7.2 PBS配制的含0.85％瓊脂糖凝膠進行瓊擴試驗，抗原抗體反應效果最好。用鴨坦布蘇病毒AH-F10株提純抗原和兔抗AH-F10抗體效價均能達到1∶32。用該血清瓊擴試驗檢測感染鴨心、脾、腎、卵巢、卵泡、淋巴結，結果陽性檢出率為83.9％，分離病毒尿囊液陽性檢出率為100％。兔抗AH-F10

9、血清不與GPV、DPV、NDV、IBDV、EDSV發(fā)生交叉反應。該方法可應用于臨床感染鴨群、免疫鴨群DTMUV及抗體的監(jiān)測，是一種操作簡便、特異性強、易于判斷、實用性強的診斷方法，適合在臨床推廣應用。
　　5、雞抗鴨坦布蘇病毒卵黃抗體的制備和臨床應用為探索高免卵黃抗體對鴨坦布蘇病毒病的防治效果，本研究以鴨坦布蘇病毒AH-F10株制備的滅活免疫制劑免疫健康高產(chǎn)蛋雞，應用瓊擴方法檢測卵黃抗體效價，收集高效價卵黃抗體，采用氯仿抽提和硫酸

10、銨鹽析法純化卵黃抗體，結果表明，免疫雞抗坦布蘇病毒卵黃抗體瓊擴效價達1∶32以上，該抗體能中和雞胚尿囊液中的坦布蘇病毒;臨床應用結果顯示，制備的抗鴨坦布蘇病毒卵黃抗體對未發(fā)病鴨預防保護率達95％以上，發(fā)病鴨群治療保護率達90％以上，表明高免卵黃抗體對防控鴨坦布蘇病毒病具有顯著的效果。
　　6、鴨坦布蘇病毒滅活油乳免疫制劑的研制和初步應用本研究將鴨坦布蘇病毒AH-F10株接種SPF雞胚，并測定病毒的毒力和滴度，結果該病毒的基礎種子批

11、病毒液ELD50為10-2.67 ELD50/0.2mL、EID50為103.05EID50/0.2mL、TCID50為1055 TCID50/0.2mL、病毒的瓊擴滴度為1∶128;生產(chǎn)種子批病毒液ELD50為10-2.55ELD50/0.2mL、EID50為103.09EID50/0.2mL、TCID50為105.9 TCID50/0.2mL、病毒滴度為1∶128。以甲醛和β-丙內(nèi)酯(BLP)分別滅活病毒，結果表明，0.3％甲醛或0

12、.05％BPL即可以獲得最佳滅活效果。使用水相、油相包埋乳化技術，選用不同的水相、油相比例，用ATS機器乳化，通過調整油苗佐劑成分最佳配比，最后確認HLB7.0，乳化劑含量10％，油水比為5∶1的比例能提供最佳穩(wěn)定性及免疫效果、通過劑型檢驗、穩(wěn)定檢測、粘度測定、無菌檢驗、安全性檢測及保存期檢測均達到成品疫苗所需要求，最小免疫劑量為0.25mL。動物試驗結果表明，免疫后第2周可以測到特異抗體;第4周免疫組的抗體水平達到最高峰1∶64，隨后

13、抗體水平緩慢下降并保持在一定水平，第八周仍維持在1∶32。攻毒試驗表明，免疫攻毒鴨的排毒及發(fā)病率判定，本疫苗對免疫組鴨的保護率為95％以上。抗體水平在1∶32時，達到完全抵抗病毒的攻擊。田間動物試驗表明該疫苗在免疫抗AH-F10病毒抗體水平可達1∶32，達到預期免疫抗體水平，且在免疫后5個月內(nèi)保持1∶32的高效價抗體，而在免疫后5個月抗體水平出現(xiàn)下降，到免疫后6個月時保持抗體水平在1∶16，該疫苗對于免疫蛋鴨使用安全有效。通過田間試驗和