鴨坦布蘇病毒XZ-2012株的分離鑒定及囊膜蛋白抗原表位的鑒定.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病(duck Tembusu virus disease)是于2010年在我國(guó)新出現(xiàn)的一種以采食、產(chǎn)蛋下降和癱瘓為特征的禽類傳染病，其病原為鴨坦布蘇病毒(duck Tembusuvirus，DTMUV)。DTMUV主要危害鴨和鵝，也有雞群感染發(fā)病的報(bào)道，不同來(lái)源的DTMUV分離病毒株的基因同源性均高于98％。該病在蚊蟲(chóng)活躍季節(jié)發(fā)病率高，但冬季也有發(fā)病，因此傳播途徑不限于蚊媒。
　　鴨坦布蘇病毒為黃病毒科、黃病毒屬、恩塔

2、亞病毒群中的坦布蘇病毒(Tembusuvirus)。病毒的基因組為正股單鏈RNA，長(zhǎng)約11 knt，基因組結(jié)構(gòu)為5'UTR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3'UTR。囊膜蛋白(E)是DTMUV主要的表面結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，含有病毒的主要中和抗原表位。DTMUV NS1蛋白參與病毒的組裝，也可以二聚體或六聚體的形式分泌至胞外，拮抗宿主的先天性免疫。E蛋白和NS1蛋白為D

3、TMUV的2個(gè)最主要免疫保護(hù)性抗原，關(guān)于其抗原表位信息報(bào)道較少。
　　本研究分離鑒定了一株鴨源坦布蘇病毒，研究其生物學(xué)特性，測(cè)定其全基因序列，分析其基因進(jìn)化特征。應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備了4株抗DTMUV E蛋白和NS1蛋白的單克隆抗體，其中針對(duì)E蛋白的單克隆抗體能區(qū)分DTMUV和日本腦炎病毒(JEV)抗原，DTMUV囊膜蛋白特異抗原表位的發(fā)現(xiàn)為DTMUV血清學(xué)診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。具體研究如下:
　　1鴨坦布蘇病毒XZ-20

4、12株的分離鑒定與基因變異分析
　　2012年10月徐州地區(qū)某鴨場(chǎng)爆發(fā)了櫻桃谷種鴨產(chǎn)蛋驟然下降的疫病，患病鴨表現(xiàn)為發(fā)熱、采食減少、產(chǎn)蛋下降，剖檢可見(jiàn)脾腫大、卵泡出血、萎縮等。本研究從送檢病料中分離到一株鴨坦布蘇病毒，命名為DTMUV XZ-2012株。DTMUV XZ-2012株能適應(yīng)雞胚培養(yǎng)，于BHK-21細(xì)胞上第5代的病毒滴度為5×104 PFU/mL。應(yīng)用RT-PCR的方法擴(kuò)增DTMUV XZ-2012基因，測(cè)序發(fā)現(xiàn)其基因組

5、全長(zhǎng)為10990nt，編碼的多聚蛋白有3426個(gè)氨基酸。DTMUV XZ-2012株與文獻(xiàn)報(bào)道的BYD株、YY5株、JS2010株等DTMUV的全基因同源性為98.5％-99.3％。與國(guó)內(nèi)最初分離的DTMUVBYD株等相比，DTMUV XZ-2012的基因變異主要分布于E基因、NS1基因和NS2a基因，提示該病毒在自然界的流行存在一定的免疫壓力。
　　2鴨坦布蘇病毒EDⅢ蛋白單克隆抗體的制備與特性鑒定
　　用純化的鴨坦布蘇病

6、毒重組EDⅢ蛋白免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體，共獲得2株能穩(wěn)定分泌抗鴨坦布蘇病毒EDⅢ抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3C4和3D12。經(jīng)間接ELISA測(cè)定，2株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)均為1:12800。腹水效價(jià)分別為1×105和2×105。單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果顯示，3C4株單抗的亞類為IgG1κ型，3D12株單抗的亞類為IgG2bκ型。間接免疫熒光試驗(yàn)與Western blot鑒定結(jié)果表明3C4、3D12株雜

7、交瘤細(xì)胞能特異性識(shí)別細(xì)胞中鴨坦布蘇病毒的EDⅢ蛋白，與日本腦炎病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)。中和試驗(yàn)顯示這兩株單抗沒(méi)有中和活性。
　　3鴨坦布蘇病毒NS1蛋白單克隆抗體的制備
　　利用純化的鴨坦布蘇病毒NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體，共獲得2株能穩(wěn)定分泌抗鴨坦布蘇病毒NS1蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2F6和2F12。經(jīng)間接ELISA測(cè)定，2株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1:6400、1∶1280

8、0。腹水效價(jià)均為1∶1×105。單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果顯示，2F6、2F12株單抗的亞類均為IgG1，2株單抗的輕鏈均為κ型。Western blot與間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明2F6、2F12株雜交瘤細(xì)胞能特異性識(shí)別DTMUV接種細(xì)胞中的NS1蛋，2F12與日本腦炎病毒接種細(xì)胞有交叉反應(yīng)，2F6與JEV NS1沒(méi)有交叉反應(yīng)。
　　4鴨坦布蘇病毒EDⅢ蛋白B細(xì)胞表位的鑒定
　　為了對(duì)獲得的2株抗鴨坦布蘇病毒EDⅢ蛋白的單克