鴨坦布蘇病毒的遺傳演化及毒力減弱的分子基礎.pdf

1、自2010年鴨坦布蘇病毒首次在中國爆發(fā)以來，持續(xù)有鴨坦布蘇病毒病的相關報道。本文利用病毒分離、RT-PCR技術，在來自浙江、江蘇和安徽等省麻鴨病料中分離到13株鴨坦布蘇病毒，分別命名為ZJ201501、ZJ201502、ZJ201503、ZJ201504、ZJ201505、ZJ201506、ZJ201507、ZJ201508、JS201501、JS201502、AH201501、AH201502和AH201504。利用覆蓋DTMUV全基

2、因組的9對兩兩相互重疊的PCR引物，對13株病毒的全基因組進行分段RT-PCR擴增、測序、拼接，得到病毒的全基因組序列。運用MegAlign和Mega7.0軟件，將這些毒株與之前實驗室完成測序的15株分離株及從GenBank中按年份隨機選取的32株鴨坦布蘇病毒序列進行比對，并繪制了ORF核苷酸序列和E蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹。結果發(fā)現無論是基于ORF核苷酸序列還是E蛋白氨基酸序列繪制的進化樹，2015年分離的毒株位于一個獨立的小分支上

3、，位于進化樹的最上端，與GX2013G、GX2013C、CQW1和SD201120的遺傳距離較近，與早期分離的FX2010遺傳距離較遠;上述毒株的核苷酸同源性均大于96.7％，E蛋白氨基酸同源性均大于97.6％。表明DTMUV雖然發(fā)生了一定變異，但不同年代分離株的核苷酸和E蛋白的氨基酸仍然具有較高同源性。
　　為進一步了解鴨坦布蘇病毒致病性的變化，根據進化樹上的位置和病毒分離時間的不同，選取了5株病毒（SH201002、JS201

4、101、HB201214、ZJ201503和ZJ201502），通過鼻腔感染33周齡的產蛋麻鴨，每只接種103.5TCID50病毒。結果發(fā)現感染組大部分鴨子均表現出食欲不振，剖檢發(fā)現最明顯的病理變化是脾臟腫大和卵巢出血。病毒分離結果發(fā)現除SH201002外，其余分離株感染鴨的肺臟中均可分離到病毒，其它臟器中的病毒分離結果也略有不同，表明鴨坦布蘇病毒的組織嗜性可能發(fā)生了改變。JS201101接種鴨在感染后8日和12日各死亡1只，而其它病毒

5、感染鴨均沒有死亡;抗體檢測結果發(fā)現SH201002感染鴨的血清抗體轉陽時間比其余病毒感染鴨晚一些，表明坦布蘇病毒進化過程中抗原性發(fā)生了改變。
　　為進一步探究鴨坦布蘇病毒對哺乳動物的致病性，將13株鴨坦布蘇病毒分離株分別經鼻腔接種3周齡SPF BALB/c小鼠，每只感染104.0TCID50病毒。小鼠未表現出任何的臨床癥狀，小鼠的體重與PBS對照組比較未有明顯下降，只是在一定程度上抑制了小鼠的體重增長，但是臟器分離結果發(fā)現在部分分

6、離株感染小鼠的肺臟和鼻腔中可分離到病毒，說明部分分離株已經獲得了在小鼠體內復制的能力。
　　為了深入闡明影響鴨坦布蘇病毒毒力的分子基礎，以本實驗室致弱的FX2010-180P(180P)和其親本強毒FX2010為研究對象，利用反向遺傳學操作系統(tǒng)，相互替換E基因，拯救基因重組病毒r180P-FX2010E和rFX2010-180PE（本實驗室已構建）。將rFX2010、rFX2010-180PE、r180P和r180P-FX2010

7、E經肌肉感染200μL1035TCID509周齡的雌麻鴨，第2天每組中放置3只未感染的SPF健康鴨作為接觸組。結果發(fā)現rFX2010-180PE與親本強毒rFX2010相比，對鴨子表現全身性臟器感染，然而卻喪失了鴨通過接觸傳播的能力（與本實驗室之前所做的結果吻合）;而r180P-FX2010E未能獲得強毒的特性，與親本毒r180P一樣，僅能在脾臟中低水平的復制，不能在鴨群中進行水平傳播。
　　為了進一步確定對鴨子水平傳播有關鍵影響

8、的氨基酸位點，在rFX2010的背景下，將E蛋白結構域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的差異氨基酸分別進行定點突變，利用反向遺傳學操作系統(tǒng)分別拯救了3個區(qū)域突變毒株:rFX2010-EDⅠ、rFX2010-EDⅡ和rFX2010-EDⅢ，用相同的實驗方法進行了麻鴨的致病性試驗。發(fā)現rFX2010-EDⅠ和rFX2010-EDⅢ沒有改變強毒的致病性，不僅呈現全身性感染，而且可以通過接觸在鴨之間傳播;而rFX2010-EDⅡ僅能在脾臟中低水平復制，同時喪失了在

9、鴨之間傳播的能力。進一步拯救位于EDⅡ中的2個氨基酸差異的單點突變毒株rFX2010-E/E89G和rFX2010-E/D120N。動物實驗發(fā)現，rFX2010-E/E89G仍保持強毒的特性，可以通過接觸在鴨之間傳播;而rFX2010-E/D120N僅能在脾臟中低水平復制，喪失了在鴨之間傳播的能力，表現出與弱毒疫苗株180P相似的生物學特性。表明E蛋白結構域Ⅱ中的120位氨基酸由D變?yōu)镹是導致坦布蘇病毒毒力減弱的關鍵氨基酸，突變該位點能