脂質(zhì)體包被鴨坦布蘇病毒E蛋白疫苗的制備及其免疫效果研究.pdf

1、2010年3月，我國東南地區(qū)出現(xiàn)以種鴨、產(chǎn)蛋鴨嚴重產(chǎn)蛋下降為主要特征的急性傳染病。隨后，該病迅速蔓延至山東、安徽、福建、河南、河北等地，給我國的水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。2010年10月，經(jīng)過我國多個水禽崗位體系專家團隊的共同努力，最終確定導(dǎo)致該病的病原為鴨坦布蘇病毒。
　　鴨群在感染鴨坦布蘇病毒后主要臨床癥狀為：精神沉郁，食欲下降，神經(jīng)癥狀明顯，死亡率達10-30％。主要剖解變化為：卵巢、腦膜、胰腺、氣管、心臟、肝臟、脾臟、

2、肺臟、等多個器官組織出血，尤其是卵泡出血、變性和破裂明顯。
　　免疫預(yù)防是控制坦布蘇病毒感染的重要措施。由于TMUV分離株之間沒有明顯的變異，亦僅有一種血清型，因此，研制出有效、安全的疫苗進行該病的預(yù)防勢在必行。本研究旨在通過制備脂質(zhì)體包被鴨坦布蘇病毒E蛋白疫苗，并對其免疫效果進行研究，為我國的水禽養(yǎng)殖業(yè)提供一種切實有效的預(yù)防鴨坦布蘇病毒的疫苗。
　　首先，通過體外構(gòu)建pet28a-E重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入Rosetta（DE

3、3）菌株，使用終濃度為1mM的IPTG于37℃誘導(dǎo)表達5h得到重組E蛋白，并使用鎳柱對表達的蛋白進行純化，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白印跡（Western-blot）方法對表達的蛋白進行驗證。E蛋白濃縮后濃度為2.2mg·mL-1。
　　隨后，使用逆相蒸發(fā)法將純化的蛋白制備成脂質(zhì)體疫苗，并使用魚精蛋白法測定疫苗的包封率，以及對疫苗的生物安全性進行評價等。在制備脂質(zhì)體疫苗時，卵磷脂與膽固醇的摩爾比

4、為1：1，加入一定量的維生素E可抗脂質(zhì)氧化，之后對制備的疫苗進行安全性評價。脂質(zhì)體疫苗包封率檢測結(jié)果為52%，內(nèi)毒素檢測結(jié)果為2.3EU·mg-1，脂質(zhì)過氧化性檢測結(jié)果為0.12，以上指標(biāo)均符合《中華藥典》對疫苗的要求。
　　最后，通過動物試驗對疫苗的免疫效果進行評價，選用弗氏佐劑與脂質(zhì)體佐劑進行比較。選用84只1日齡櫻桃谷雛鴨進行免疫，分為7組：0組（對照組）、1組（脂質(zhì)體1日齡免疫一次）、2組（脂質(zhì)體1、7日齡免疫兩次）、3組

5、（脂質(zhì)體7日齡免疫1次）、4組（弗氏佐劑1日齡免疫一次）、5組（弗氏佐劑1、7日齡免疫兩次）、6組（弗氏佐劑7日齡免疫1次）。
　　每7d采集一次血液檢測血清中抗體水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）方法進行抗體檢測，結(jié)果顯示：2組（脂質(zhì)體1、7日齡免疫兩次）比其他組產(chǎn)生的抗體量更高，且抗體持續(xù)時間更久，抗體在第四周達到最高值，一直到實驗結(jié)束后依然保持在陽性

6、值以上。在疫苗免疫三周后對櫻桃谷鴨進行攻毒實驗，接種劑量為每只鴨1mL102.4 TCID50，接毒后，每組隨機挑選6只每天無菌采集一次血漿，用于病毒血癥的檢測，無菌采集雛鴨泄殖腔棉拭子及口咽棉拭子，檢測病毒排放情況。病毒血癥及病毒排毒量檢測情況看，脂質(zhì)體疫苗免疫兩次組無病毒陽性檢出，其他組均有不同程度的病毒陽性檢出。通過抗體水平及病毒排放情況看，脂質(zhì)體疫苗免疫兩次組的免疫保護效果優(yōu)于其他組。
　　本研究為脂質(zhì)體包被鴨坦布蘇病毒E