鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、坦布蘇病毒(Tembusu，TMUV)是禽坦布蘇病毒病的主要病原。2010年4月坦布蘇病毒病開始在我國(guó)東南沿海養(yǎng)鴨場(chǎng)爆發(fā)，引起產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量大幅度下降、并伴隨感染鴨死亡，給我國(guó)沿海地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)該新發(fā)病毒進(jìn)行深入研究以及建立一種能穩(wěn)定檢測(cè)該病毒的血清學(xué)方法，有助于該疫病的有效防控。本研究體外重組表達(dá)了TMUV囊膜E蛋白的截短蛋白，并制備了其單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)，利用制備的單抗分析

2、了識(shí)別E蛋白的抗原區(qū)域。同時(shí)以原核表達(dá)的重組截短E蛋白為包被抗原，建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)方法，用于TMUV血清抗體的檢測(cè)。
　　本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)分離的坦布蘇病毒YY1株全基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以YY1毒株的核酸為模板，通過RT-PCR法擴(kuò)增了除去YY1 E基因疏水區(qū)和跨膜區(qū)的編碼截短E蛋白基因，然后克隆到pET-28a(+)原核表達(dá)載

3、體上。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) plysS菌株，獲得陽(yáng)性重組菌，并在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)了His標(biāo)簽的融合截短E蛋白。采用Ni-NTA鎳柱純化出較高純度的重組蛋白，命名為His-YY1E。
　　以純化的His-YY1E蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過三次免疫和一次加強(qiáng)免疫后，取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。經(jīng)過HAT和HT選擇培養(yǎng)基初步篩選融合的雜交瘤細(xì)胞;再經(jīng)過間接ELISA和間接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)

4、(IFA)篩選后，最終篩選出4株能穩(wěn)定分泌抗截短E蛋白抗體的細(xì)胞株。將特異性的細(xì)胞株腹腔注射小鼠制備YY1E單克隆抗體腹水，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn):4株抗截短E蛋白的單克隆抗體在Westemblot和IFA檢測(cè)中均能特異性地與原核表達(dá)重組蛋白及TMUV感染細(xì)胞中天然E蛋白反應(yīng)。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染截短蛋白E不同區(qū)域截短體與pEGFP-C3構(gòu)建的真核表達(dá)載體質(zhì)粒，IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，1C5、3B11、3C5、3F5單抗識(shí)別的截短E蛋白抗原區(qū)域位于C端35個(gè)

5、氨基酸（105個(gè)堿基）之間。
　　最后本研究對(duì)鴨坦布蘇病毒血清抗體檢測(cè)方法進(jìn)行了初步研究，即建立了基于原核表達(dá)重組截短E蛋白為包被抗原的ELISA檢測(cè)方法。并優(yōu)化E蛋白包被的ELISA檢測(cè)條件，E蛋白包被最佳工作條件為碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原至3.5μg/mL，4℃過夜包被抗原，1％BSA封閉，1∶100稀釋待檢測(cè)血清，37℃孵育30min，1∶8000稀釋HRP羊抗鴨，37℃孵育1h，TMB底物37℃反應(yīng)10min后終止反應(yīng)，讀