豬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的初步建立.pdf

1、以純化的重組細(xì)小病毒的VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，通過細(xì)胞融合技術(shù)，間接ELISA篩選和3次以上細(xì)胞克隆，獲得了5株穩(wěn)定分泌抗PPV VP2蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2D5、1F11、2B4、3C8、1H3。5株雜交瘤細(xì)胞染色體平均數(shù)均為88±10對，分泌抗體亞類4株為IgM類，分別是1F11、2B4、3C8、1H3；1株雜交瘤細(xì)胞2D5為IgG2a，5株雜交瘤細(xì)胞2D5、1F11、2B4、3C8、1H3制備的細(xì)胞上清抗

2、體ELISA效價分別為1: 5000、1: 2000、1: 1000、1: 800、1: 800，腹水抗體效價分別為1: 106、1: 105、1: 104、1: 104、1: 104。
　　 Western blot檢測表明5株單抗均識別豬細(xì)小病毒VP2蛋白；間接免疫熒光鑒定表明5株單抗均與PPV全病毒發(fā)生反應(yīng)；而不與TEGV、PRV和PEDV反應(yīng)，與豬細(xì)小病毒具有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)。并且5株雜交瘤細(xì)胞在體外連續(xù)傳代3個月和凍存

3、后再復(fù)蘇均不能影響抗體分泌的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果均表明，所制備的PPV VP2蛋白單克隆抗體對病原檢測具有很高的特異性，PPV VP2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立為PPV病原基礎(chǔ)性研究和以此抗體建立病原特異性免疫學(xué)檢測方法奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 為建立細(xì)小病毒雙抗體夾心ELISA方法，制備了兔源抗豬細(xì)小病毒血清抗體。主要制備過程是用ST細(xì)胞繁殖細(xì)小病毒（PPV），經(jīng)測定該病毒的TCID50為10-4.6，0.1mL，該病毒經(jīng)高

4、速離心和蔗糖密度梯度離心純化后免疫家兔。對制備的單克隆抗體和多克隆抗體利用辛酸-飽和硫酸銨法和親和層析柱聯(lián)合法進(jìn)行了抗體的純化，純化后的多抗?jié)舛葹?.9mg/mL，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，純度為100％。純化后的單抗?jié)舛葹?.23mg/mL，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，純度為100％。
　　 以純化的多抗和單克隆抗體為基本檢測試劑，進(jìn)行了雙抗體夾心ELISA方法檢測病毒的探索，