犬細(xì)小病毒VP2的原核高效表達(dá)及特異單克隆抗體的研制.pdf

1、犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus，CPV)是單股DNA病毒，無(wú)囊膜，基因組全長(zhǎng)5323bp，VP2全長(zhǎng)1755bp，其編碼的蛋白占整個(gè)衣殼蛋白的90％，是中和抗體的主要抗原表位，是制備CPV基因工程疫苗的重要侯選保護(hù)性抗原。CPV可引出嚴(yán)重的出血性腸炎和心肌炎。該病一年四季皆可發(fā)生，發(fā)病急、病程短、傳染性強(qiáng)、死亡率高，對(duì)實(shí)驗(yàn)犬、軍犬、警犬等集中飼養(yǎng)的犬群具有很大的危險(xiǎn)性，故對(duì)感染犬作出及時(shí)診斷，以便采取措施防止蔓延甚為重要

2、。本研究對(duì)VP2基因分段進(jìn)行原核表達(dá)，以CPV-VP2基因重組質(zhì)粒為模板，通過(guò)蛋白質(zhì)分析軟件分析，把VP2基因分成不同區(qū)段，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物并擴(kuò)增出相應(yīng)片段。按常規(guī)方法克隆入pGEX-4T-2載體谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)目的基因片段的表達(dá)，經(jīng)超聲處理后SDS．PAGE電泳證明K2和K4片段獲得了良好的可溶性表達(dá)，其表達(dá)的GST融合蛋白的分子質(zhì)量分別為38.3KDa和41KD

3、a，并對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了純化。經(jīng)過(guò)間接ELISA、Westem blot鑒定，表明采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的融合蛋白具有與CPV陽(yáng)性抗體特異結(jié)合的良好抗原性。用純化的重組VP2融合蛋白作為篩選抗原，用提純的CPV作為免疫原，經(jīng)亞克隆得到6株穩(wěn)定分泌CPV-VP2單抗的雜交瘤，分別命名為：3D9C4、4F11D5、5F10F5、4F987、4G9G11、5F11C11；中和試驗(yàn)表明：5F10F5、4F987、4G9G11、5F1

4、lCll四株有中和作用，且沒(méi)有發(fā)生與犬類其他病毒發(fā)生交互反應(yīng)的現(xiàn)象；經(jīng)鑒定5F11C11和4G9G11相對(duì)具有較高的分泌抗體能力，腹水的效價(jià)在1：10萬(wàn)倍以上。之后，用直接ELISA方法區(qū)分了5F10F5、4F987、4G9G11、5F11C11四株分泌的針對(duì)CPV不同抗原決定簇的幾株單抗。結(jié)果表明，5F10F5、4G9G11與5F11C1l針對(duì)不同一抗原決定簇。上述成果可用于CPV特異性診斷、CPV病的抗體治療、VP2蛋白功能的研究和