鵝細小病毒VP3基因的克隆、序列比較及原核表達.pdf

1、鵝細小病毒(Goose Parvovirus,GPV)為細小病毒科細小病毒屬成員,它引起雛鵝發(fā)生以急性腸炎及肝、腎、心實質(zhì)器官炎癥為特征的烈性傳染病-小鵝瘟.GPV致病性強,所致疾病死率高,對養(yǎng)鵝業(yè)的危害嚴重.中國學者方定-1956年首先發(fā)現(xiàn)了本病,并分離出GPV.在此之后,國外許多國家相繼分離到該病毒,證實了該病毒在世界范圍內(nèi)有較為廣泛的分布.VP3為GPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,占病毒結(jié)構(gòu)蛋白的80％,是主要免疫保護性抗原.因此,對VP3基

2、因及其產(chǎn)物的研究對小鵝瘟的防制有重要理論價值和實踐意義.該實驗根據(jù)Zadori等發(fā)表的GPV B株基因序列合成了擴增GPV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因的上下游引物GF\GR.利用這對引物,分別將來自國內(nèi)的4個GPV毒株,通過PCR技術(shù)從病毒基因組DNA中擴增出病毒VP3完整基因片段,將之與pMD18-T質(zhì)粒載體連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,提取重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后,對插入片段進行序列測定及比較分析.序列測定結(jié)果為:4個GPV毒株

3、的VP3基因全長均為1605bp,編碼534個氨基酸.序列分析比較表明,不同毒株VP3基因同源性較高(95.64％~99.81％),而強弱毒株之間有5個氨基酸存在共性差別.另設計一對帶有酶切位點的PCR擴增引物,對其中1株GPV的VP3基因重新進行了PCR擴增,并將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T質(zhì)粒載體.經(jīng)酶切鑒定和序列測定后,再將帶有粘性末端的VP3基因片段亞克隆到pGEX表達載體系統(tǒng)的pGEX-6p-1質(zhì)粒,構(gòu)建了原核表達載體pGE

4、X-6p-VP3.將pGEX-6p-VP3再轉(zhuǎn)化表達宿主BL21(DE3)plysS,經(jīng)IPTG誘導,成功地表達了帶有融合蛋白GST的VP3(GST-VP3).SDS-PAGE分析表明,利用pGEX表達載體系統(tǒng)所表達的GST-VP3,分子質(zhì)量約為88ku,其中VP3約為58ku.該實驗在基因和分子水平上說明了VP3基因的保守性和GPV單一血清型的分子生物學基礎,并為進一步研究VP3蛋白的理化特性和分子生物學特性提供了必要的條件.這為確立