小鵝瘟病毒VP3基因真核表達質(zhì)粒在小鼠中的免疫效果.pdf

1、小鵝瘟是由鵝細小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雛鵝急性或亞急性敗血性傳染病，以滲出性腸炎、小腸黏膜表層大片壞死脫落、腸道栓塞為特征性病變，該病主要侵害出殼后4～20日齡的雛鵝和番鴨。 自1956年我國學者方定一在江蘇揚州首先發(fā)現(xiàn)并檢出小鵝瘟病毒以來，國內(nèi)外學者對小鵝瘟病毒展開了一系列的研究。我國養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展勢態(tài)好，而小鵝瘟是一種傳染速度快、發(fā)病率和死亡率可高達90％～100％的疾病，一旦爆發(fā)將給養(yǎng)鵝戶帶來巨

2、大的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)疫苗對GPV的預防和控制起到了一定的積極作用，但其自身也存在著不可避免的缺點，如滅活苗存在某些重要抗原表位的丟失，免疫原性差；弱毒苗容易發(fā)生毒力返祖，干擾檢疫等諸多問題，而應用核酸疫苗則不存在這些問題。同傳統(tǒng)的滅活疫苗以及弱毒疫苗比較，核酸疫苗具有以下優(yōu)點：在機體內(nèi)穩(wěn)定表達，免疫時間長；避開了病原微生物，無感染的潛在危險；所需劑量低，只要ng水平即可發(fā)揮作用。 鵝細小病毒VP3基因是GPV主要保護性抗原基因，其

3、編碼的蛋白為病毒核衣殼的主要成分，約占總蛋白含量的80％，且暴露于病毒粒子表面，能誘導機體產(chǎn)生中和作用的抗體。對VP3基因真核表達質(zhì)粒的免疫效果進行研究，為鵝細小病毒核酸疫苗的研制打下基礎。 本實驗將空載體質(zhì)粒pVAXⅠ和本實驗室已成功構建的、能夠高效率轉染Vero細胞的重組真核表達質(zhì)粒pVAXⅠ/VP3，通過堿裂解法進行大量提取。用真核表達質(zhì)粒pVAXⅠ/VP3、空載體質(zhì)粒pVAXⅠ和生理鹽水分別肌肉注射免疫10只6周齡的BA

4、LB/c健康雌性小鼠，共免疫四次。 無菌條件下，取出免疫小鼠脾臟，分離淋巴細胞，以淋巴細胞轉化試驗胞內(nèi)酶MTT法應用特異性抗原GPV刺激檢測T淋巴細胞的增殖程度，以流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量，通過SPSS11.5版統(tǒng)計軟件分析后，pVAXⅠ/VP3實驗組、pVAXⅠ對照組和生理鹽水對照組三組的結果在T淋巴細胞增殖程度和細胞數(shù)量上均未達到統(tǒng)計學的顯著水平。由此說明，本實驗室構建的重組真核表達質(zhì)粒pV

5、AXⅠ/VP3誘導小鼠產(chǎn)生細胞免疫能力不強。這一結果與張中洋等報道的研究結果相似，但產(chǎn)生這種結果的原因目前尚不清楚，推測可能與免疫小鼠的生理狀況或個體差異及淋巴細胞轉化試驗影響因素多等有關。 分離免疫小鼠的血清，并參照李茂祥老師的方法，采用2.2％NaCl、6％ PEG濃縮病毒，Sepharose-4B柱層析，提純GPV抗原。采用雙方陣滴定法確定純化的GPV抗原的最佳工作濃度為10μg/mL，免疫重組表達質(zhì)粒pVAXⅠ/VP3的

6、鼠混合血清的最佳工作稀釋度為1：600，以此建立檢測小鵝瘟特異性抗體的間接ELISA法。應用上述建立的間接ELISA法檢測免疫小鼠血清中GPV特異性抗體的水平，通過SPSS11.5版統(tǒng)計軟件分析后pVAXⅠ/VP3免疫組分別與pVAXⅠ對照組和陰性生理鹽水對照組這兩個組別的GPV特異性抗體水平差異顯著，而pVAXⅠ對照組與陰性生理鹽水對照組的GPV特異性抗體水平無顯著差異。并且小鼠pVAXⅠ/VP3免疫組含有的GPV特異性抗體水平明顯高