小鵝瘟病毒延邊分離株VP3基因克隆及單管巢式PCR診斷方法的建立.pdf

1、小鵝瘟是由小鵝瘟病毒引起的主要侵害4-20日齡雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性、高度接觸性和敗血性傳染病，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重危害。該病可從臨床癥狀及流行病學(xué)特點(diǎn)作出初步診斷，但確診需借助病原學(xué)檢查、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)。病原學(xué)檢查和血清學(xué)方法均存在不夠敏感、檢測所需時(shí)間長等不足，不能滿足臨床快速診斷小鵝瘟的需要。而PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠較好滿足臨床快速準(zhǔn)確診斷疾病的需要。
　　本試驗(yàn)根據(jù)GenBank發(fā)表

2、的小鵝瘟病毒B株全基因序列，針對VP3基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)了一對擴(kuò)增主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因的特異性引物，對小鵝瘟病毒延邊分離株基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，得到了與預(yù)期大小一致的VP3完整基因片段，將其回收純化后與 pGEM-T Easy載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中進(jìn)行克隆，經(jīng)酶切分析、PCR鑒定及序列分析，驗(yàn)證了所克隆的基因是小鵝瘟病毒VP3基因。同時(shí)，建立了小鵝瘟病毒單管巢式PCR診斷方法，擴(kuò)增出了與預(yù)期片段大小相

3、符的長度為406bp的基因片段。特異性試驗(yàn)表明，只有小鵝瘟病毒模板能擴(kuò)增出特異性條帶。敏感性試驗(yàn)表明，當(dāng)病料中小鵝瘟病毒核酸含量為0.02175fg/μL時(shí)，仍可以檢測到，出現(xiàn)清晰的特異性片段，比小鵝瘟病毒常規(guī)PCR診斷方法敏感性高100倍。應(yīng)用小鵝瘟病毒單管巢式PCR診斷方法和小鵝瘟病毒常規(guī)PCR診斷方法分別對延邊地區(qū)疑似小鵝瘟病死雛鵝80只進(jìn)行了檢測，有典型病理變化的20只病死雛鵝，陽性檢出率均為100％（20/20），無典型病理變