串聯(lián)不同分子佐劑的小鵝瘟病毒VP3基因疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、小鵝瘟(GoslingPlague)是嚴(yán)重危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一，其防制措施主要依靠疫苗接種，傳統(tǒng)疫苗在預(yù)防和控制小鵝瘟?xí)r，存在著散毒和免疫應(yīng)答不完全等缺點。基因疫苗符合未來疫苗的發(fā)展方向，具有安全和誘導(dǎo)全面的免疫應(yīng)答等諸多優(yōu)點。本研究以小鵝瘟病毒(GooseParvovirus，GPV)VP3為研究對象，構(gòu)建了VP3單基因DNA疫苗，為了增強VP3基因疫苗的免疫原性，將鵝白介素-2(GooseInterleukin-2，gIL

2、-2)和VP3基因進行串聯(lián)融合表達，還嵌入了一段CpG免疫刺激序列，將構(gòu)建的三種基因疫苗分別免疫28日齡雛鵝和種鵝，并對其誘導(dǎo)鵝產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫進行了比較研究，為研制高效小鵝瘟病毒VP3基因疫苗打下了基礎(chǔ)。 1.為了探索GPVVP3基因構(gòu)建基因疫苗的可行性，通過PCR擴增和基因重組技術(shù)克隆了GPVVP3基因并將其連接到pMD18T-Simple上，在對VP3基因分子特性、遺傳特點和抗原性進行了分析之后，亞克隆到pcDNA

3、3.1(+)CMV啟動子下游的HindIII和BamHI酶切位點之間，構(gòu)建了單獨表達GPVVP3基因的基因疫苗載體pcDNA-VP3，將其轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS-7后，利用間接免疫熒光抗體試驗可以在轉(zhuǎn)染后48h檢測到VP3基因的高效表達。 2.通過重疊延伸PCR(SplicingbyoverlapextentionPCR)擴增gIL2-VP3串聯(lián)基因，包含缺失了TAA終止密碼子的gIL-2基因和缺失了ATG起始密碼子的VP3基因，兩

4、個基因之間以高親水性氨基酸(Gly-Gly-Gly-Ser)編碼核苷酸相連接；將gIL2-VP3融合基因通過基因重組技術(shù)正向插入到到pcDNA3.1(+)CMV啟動子的下游HindIII和BamHI酶切位點之間，構(gòu)建了表達gIL2-VP3融合基因的pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗載體，可以在COS-7細(xì)胞內(nèi)高效表達，表達產(chǎn)物的IL-2生物活性可達31.57U/ml。pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗載體，可以在COS-7細(xì)胞內(nèi)高效

5、表達，表達產(chǎn)物的IL-2生物活性可達31.57U/ml。 3.人工合成在禽體內(nèi)具有免疫刺激作用的CpG序列，克隆到pMD18T-Simple載體上，然后亞克隆定向插入到pcDNA-gIL2-VP3目的基因終止密碼子后的BamHI和XbaI酶切位點之間，構(gòu)建成pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗載體，對鵝外周淋巴細(xì)胞增殖具有較強的刺激活性(SI=3.06)。 4.將三種基因疫苗以50μg、100μg和200μg的不

6、同劑量分別免疫28日齡鵝，分別于基因免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d和49d頸靜脈采集免疫鵝的抗凝血，分離外周血淋巴細(xì)胞后，利用MTT比色法檢測ConA對鵝外周血淋巴細(xì)胞增殖的免疫刺激作用，發(fā)現(xiàn)鵝在免疫pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG后第28d體內(nèi)細(xì)胞免疫最強，200μgpcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫組外周血淋巴細(xì)胞的ConA刺激指數(shù)顯著高于pcDNA-gIL2-VP3各組(

7、P<0.05)：顯著高于單基因基因疫苗pcDNA-VP3各個劑量組(P<0.05)。含有佐劑的pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG兩種基因疫苗細(xì)胞免疫的峰值比單基因VP3DNA疫苗提前7d。 5.將三種基因疫苗以50μg、100μg和200μg不同劑量免疫28日齡鵝，分別于免疫后第3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、105d、133d、161d、189d、217d，采用間接E

8、LISA的方法檢測鵝體內(nèi)IgG的動態(tài)變化規(guī)律，結(jié)果顯示，pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG所誘導(dǎo)的體液免疫水平明顯高于pcDNA-VP3單基因組，這兩種基因疫苗的各個劑量組均在第35d抗體水平達到最高，其中以200μgpcDNA-gIL2-VP3/CpG的ELISA水平最高，顯著區(qū)別于pcDNA-VP3各劑量免疫組(P<0.05)和極顯著高于各個對照組(P<0.01)。從pcDNA-gIL2-VP3和pc

9、DNA-gIL2-VP3/CpG誘導(dǎo)鵝的體液免疫強度和維持時間來看，均優(yōu)于pcDNA-VP3免疫鵝和GPV弱毒免疫鵝。 6.將三種基因疫苗以200μg的劑量免疫28日齡鵝，分別于免疫后第15d、30d、45d、60d和75d，采用微量血清中和試驗檢測基因免疫所誘導(dǎo)的中和抗體水平，結(jié)果顯示，免疫后第15d就可以檢測到中和抗體，鵝血清中和抗體隨時間的推移穩(wěn)定中有所緩慢上升，pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/

10、CpG免疫后第60d的鵝血清中和抗體平均效價分別達到峰值1:178.5和1:198.2，二者之間差異不顯著，但是顯著高于pcDNA-VP3和GPV弱毒免疫鵝(P<0.05)。 7.將三種GPVVP3基因疫苗以200μg的劑量肌肉注射免疫開產(chǎn)前母鵝，分別在免疫后第7d、14d、28d、42d、56d和第70d收集免疫母鵝所產(chǎn)鵝蛋用作卵黃抗體的檢測，另外在免疫后第14d、28d、42d取一批鵝蛋入孵用以孵化小鵝用作雛鵝攻毒保護試驗。