噬菌體展示多表位疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、表位疫苗(epitopevaccine)是用抗原表位制備的疫苗。多表位疫苗(polytopevaccine)是同時(shí)攜帶多個(gè)目標(biāo)抗原相關(guān)表位以及輔助性表位的疫苗，可以簡化免疫計(jì)劃。用基因工程的方法制備多表位疫苗成為未來聯(lián)合疫苗的發(fā)展趨勢：(1)多表位疫苗能克服主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的遺傳限制，多表位可以被多種遺傳背景的MHC分子識(shí)別并結(jié)合而達(dá)到高效提呈；(2)可以避免傳統(tǒng)的滅活或減毒疫苗存在的生物危害性和毒力返祖等問題；(3)

2、在誘生細(xì)胞免疫方面有獨(dú)特優(yōu)勢。 噬菌體展示技術(shù)是將外源基因插入到噬菌體信號(hào)肽基因和衣殼蛋白編碼基因之間，從而使外源基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)與衣殼蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌體表面，被展示的外源肽或蛋白可保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。噬菌體疫苗是以噬菌體作為疫苗載體，將特異表位展示在噬菌體顆粒表面，構(gòu)建成不同表位特異的噬菌體疫苗，具有病毒樣顆粒特性，能引發(fā)強(qiáng)的針對表位的特異性免疫應(yīng)答。研究表明噬菌體展示技術(shù)是一個(gè)簡單、有效的表達(dá)

3、疫苗表位的工具。 噬菌體疫苗兼有蛋白疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)。它比痘苗病毒、腺病毒等病毒載體制備更方便、安全，比一般的蛋白疫苗更易于制備和純化，而且沒有DNA疫苗的基因安全問題。T7噬菌體是一種烈性噬菌體，已完成全序列分析，遺傳背景清楚。與λ噬菌體和絲狀噬菌體相比，T7噬菌體更易培養(yǎng)且繁殖更快。T7噬菌體復(fù)制周期短，胞質(zhì)蛋白組裝、操作和儲(chǔ)存方便，克隆效率高，以及T7噬菌體對理化因素抵抗力強(qiáng)等特點(diǎn)也使得T7噬菌體展示系統(tǒng)優(yōu)于其它的噬

4、菌體展示系統(tǒng)。 鼻腔免疫是近年發(fā)展起來新的粘膜免疫途徑，它通過抗原在鼻粘膜的釋放，誘導(dǎo)系統(tǒng)和粘膜免疫應(yīng)答。研究表明，由T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞以及包括M細(xì)胞的隱窩吸收上皮細(xì)胞組成的鼻粘膜相關(guān)淋巴組織(noseassociatedlymphoidtissue，NALT)，是鼻腔免疫的誘導(dǎo)部位。目前關(guān)于鼻腔疫苗釋放系統(tǒng)的研究主要集中在研制新抗原、篩選合適的釋放載體和疫苗佐劑、探索抗原釋放機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)鼻腔免疫應(yīng)答的細(xì)胞和分子機(jī)理等方面

5、。殼聚糖是一個(gè)新型的緩控釋疫苗呈遞系統(tǒng)載體，能安全而有效地促進(jìn)鼻腔吸收微球疫苗。 由于T7噬菌體作為疫苗載體在新型疫苗的研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，本文利用基因重組將乙肝乙腦麻疹(HBV-JEV-MV)多表位基因片斷與T710B衣殼蛋白基因融合，使多表位與T710B蛋白融合，構(gòu)建噬菌體疫苗。PCR鑒定為陽性的噬菌體疫苗用甲醛滅活。進(jìn)一步采用殼聚糖制備噬菌體微球疫苗，經(jīng)環(huán)境掃描電鏡觀察，微球表面光滑，直徑約1.5μm。為了驗(yàn)證噬菌體載

6、體疫苗和噬菌體微球疫苗是否具有免疫原性，選用1010pfu和1012pfu不同劑量噬菌體疫苗和噬菌體微球疫苗經(jīng)鼻腔免疫、腹股溝皮下注射和腹腔注射免疫小鼠，研究其誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。 ELISA檢測血清IgG水平發(fā)現(xiàn)，噬菌體疫苗具有特異性免疫原性，能誘導(dǎo)針對HBV、JEV、MV的特異性抗體，而且不同免疫劑量的平行實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)的抗體水平與免疫劑量正相關(guān)。噬菌體微球疫苗通過不同方式免疫均有一定的免疫效果，且鼻腔和皮下注射兩種方式免疫效果

7、顯著優(yōu)于非微球液體疫苗(P＜0.05)。 為了驗(yàn)證噬菌體顆粒本身作為佐劑的能力，我們同時(shí)設(shè)計(jì)了非微球1010pfu鋁佐劑腹腔注射免疫組。血清抗體檢測結(jié)果顯示鋁佐劑組與非鋁佐劑組相比抗體水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)。此結(jié)果提示噬菌體本身具有一定的佐劑效應(yīng)，可以在不添加鋁佐劑的條件下有效激發(fā)特異性免疫反應(yīng)。 因此，(1)我們構(gòu)建的噬菌體疫苗能有效誘導(dǎo)多表位特異性的體液免疫應(yīng)答；(2)我們制備的殼聚糖微球疫苗經(jīng)鼻腔免疫能有