噬菌體展示多表位疫苗的構建及免疫原性研究.pdf

1、表位疫苗(epitopevaccine)是用抗原表位制備的疫苗。多表位疫苗(polytopevaccine)是同時攜帶多個目標抗原相關表位以及輔助性表位的疫苗，可以簡化免疫計劃。用基因工程的方法制備多表位疫苗成為未來聯合疫苗的發(fā)展趨勢：(1)多表位疫苗能克服主要組織相容性復合物(MHC)分子的遺傳限制，多表位可以被多種遺傳背景的MHC分子識別并結合而達到高效提呈；(2)可以避免傳統(tǒng)的滅活或減毒疫苗存在的生物危害性和毒力返祖等問題；(3)

2、在誘生細胞免疫方面有獨特優(yōu)勢。 噬菌體展示技術是將外源基因插入到噬菌體信號肽基因和衣殼蛋白編碼基因之間，從而使外源基因編碼的多肽或蛋白質與衣殼蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌體表面，被展示的外源肽或蛋白可保持相對獨立的空間結構和生物活性。噬菌體疫苗是以噬菌體作為疫苗載體，將特異表位展示在噬菌體顆粒表面，構建成不同表位特異的噬菌體疫苗，具有病毒樣顆粒特性，能引發(fā)強的針對表位的特異性免疫應答。研究表明噬菌體展示技術是一個簡單、有效的表達

3、疫苗表位的工具。 噬菌體疫苗兼有蛋白疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點。它比痘苗病毒、腺病毒等病毒載體制備更方便、安全，比一般的蛋白疫苗更易于制備和純化，而且沒有DNA疫苗的基因安全問題。T7噬菌體是一種烈性噬菌體，已完成全序列分析，遺傳背景清楚。與λ噬菌體和絲狀噬菌體相比，T7噬菌體更易培養(yǎng)且繁殖更快。T7噬菌體復制周期短，胞質蛋白組裝、操作和儲存方便，克隆效率高，以及T7噬菌體對理化因素抵抗力強等特點也使得T7噬菌體展示系統(tǒng)優(yōu)于其它的噬

4、菌體展示系統(tǒng)。 鼻腔免疫是近年發(fā)展起來新的粘膜免疫途徑，它通過抗原在鼻粘膜的釋放，誘導系統(tǒng)和粘膜免疫應答。研究表明，由T細胞、B細胞、樹突細胞以及包括M細胞的隱窩吸收上皮細胞組成的鼻粘膜相關淋巴組織(noseassociatedlymphoidtissue，NALT)，是鼻腔免疫的誘導部位。目前關于鼻腔疫苗釋放系統(tǒng)的研究主要集中在研制新抗原、篩選合適的釋放載體和疫苗佐劑、探索抗原釋放機制以及發(fā)現鼻腔免疫應答的細胞和分子機理等方面

5、。殼聚糖是一個新型的緩控釋疫苗呈遞系統(tǒng)載體，能安全而有效地促進鼻腔吸收微球疫苗。 由于T7噬菌體作為疫苗載體在新型疫苗的研究方面具有獨特的優(yōu)勢，本文利用基因重組將乙肝乙腦麻疹(HBV-JEV-MV)多表位基因片斷與T710B衣殼蛋白基因融合，使多表位與T710B蛋白融合，構建噬菌體疫苗。PCR鑒定為陽性的噬菌體疫苗用甲醛滅活。進一步采用殼聚糖制備噬菌體微球疫苗，經環(huán)境掃描電鏡觀察，微球表面光滑，直徑約1.5μm。為了驗證噬菌體載

6、體疫苗和噬菌體微球疫苗是否具有免疫原性，選用1010pfu和1012pfu不同劑量噬菌體疫苗和噬菌體微球疫苗經鼻腔免疫、腹股溝皮下注射和腹腔注射免疫小鼠，研究其誘導的體液免疫應答。 ELISA檢測血清IgG水平發(fā)現，噬菌體疫苗具有特異性免疫原性，能誘導針對HBV、JEV、MV的特異性抗體，而且不同免疫劑量的平行實驗組誘導的抗體水平與免疫劑量正相關。噬菌體微球疫苗通過不同方式免疫均有一定的免疫效果，且鼻腔和皮下注射兩種方式免疫效果

7、顯著優(yōu)于非微球液體疫苗(P＜0.05)。 為了驗證噬菌體顆粒本身作為佐劑的能力，我們同時設計了非微球1010pfu鋁佐劑腹腔注射免疫組。血清抗體檢測結果顯示鋁佐劑組與非鋁佐劑組相比抗體水平沒有顯著差異(P＞0.05)。此結果提示噬菌體本身具有一定的佐劑效應，可以在不添加鋁佐劑的條件下有效激發(fā)特異性免疫反應。 因此，(1)我們構建的噬菌體疫苗能有效誘導多表位特異性的體液免疫應答；(2)我們制備的殼聚糖微球疫苗經鼻腔免疫能有