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文檔簡介
1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的世界性傳染病,尤其是在發(fā)展中國家形勢更加嚴峻,我國是世界上結(jié)核病發(fā)病率最高的22個國家之一,結(jié)核病患病人數(shù)僅次于印度,位居第二。卡介苗是目前唯一應(yīng)用于結(jié)核的預(yù)防性疫苗,但對于成人肺結(jié)核的保護效力十分有限,再加上其自身的不足以及外界因素的變化,研制新型的結(jié)核疫苗對于結(jié)核病的防治來講顯得尤為重要。
DNA疫苗是一種常見的基因疫苗,1993年Ulmer等首篇研究報道發(fā)表在Science上之后,該發(fā)現(xiàn)立
2、即被視為疫苗領(lǐng)域的一場革命,開辟了疫苗研究的新時代。從此,基因疫苗成為世界矚目的防治傳染病的研究新熱點。
本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建新型的結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗,即pVAX1-Rv1419重組質(zhì)粒,并評價了該疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性。
一、Rv1419基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
以H37Rv基因組為模板,通過PCR擴增rv1419基因,獲得長401bp的rv1419基因片段,回收目的基因片段插入pGEM-T載體
3、中,經(jīng)酶切鑒定與序列測定證實后,雙酶切回收目的基因片段,再與雙酶切后的真核表達載體pVAX1連接,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pVAX1-Rv1419。重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-Rv1419經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實構(gòu)建成功。應(yīng)用金牌超量無內(nèi)毒素試劑盒大量提取并純化質(zhì)粒DNA。
二、Rv1419DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性評價
將50只BALB/c雌性小鼠隨機分為5組,每組10只,分別用生理鹽水、pVAX1載體、微卡菌苗、Ag
4、85A DNA疫苗、Rv1419 DNA疫苗免疫,通過雙側(cè)脛前肌注射的方法免疫小鼠,每2周免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后3周殺死小鼠。通過ELISA方法檢測血清中抗Rv1419的IgG抗體;利用ELISA方法檢測小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4表達水平;應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測外周血單個核細胞內(nèi)分泌IFN-γ的Th1和分泌IL-4的Th2細胞百分比以及Th1/Th2比值。結(jié)果顯示Rv1419 DNA疫苗免疫的小鼠特異性抗體Ig
5、G高于生理鹽水組和載體質(zhì)粒組(p<0.05),與微卡菌苗組無顯著性差異。Rv1419DNA疫苗組脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平顯著高于生理鹽水組、載體質(zhì)粒組和微卡菌苗組(p<0.05),但低于Ag85A DNA疫苗組。Rv1419 DNA疫苗組Th1細胞百分比顯著高于生理鹽水組和載體組(p<0.01),且Th1/Th2細胞比值顯著高于生理鹽水組和載體組(p<0.01),與微卡菌苗組和Ag85A DNA疫苗組無顯著性差異。
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