安全高效HPV16E7 DNA疫苗的構(gòu)建及免疫原性分析.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文安全高效HPV16E7DNA疫苗的構(gòu)建及免疫原性分析姓名：左亞剛申請學位級別：博士專業(yè)：皮膚性病學指導教師：王家璧2003.4.1中因醫(yī)學科學院博士生畢業(yè)論文 2周，摘除眼球取血，分離血清，測定E 7 特異性抗體。然后處死小鼠，取脾臟，分離脾細胞，R P M I 一1 6 4 0 培養(yǎng)基中加或不加特異性E 7 多肽，培養(yǎng)6 天后，E L I S P O T和E L I S A 分別測定培養(yǎng)上清液中I L ．2

2、 和1 F N ．y 的水平，同時以c 3 細胞為靶細胞、E 7 多肽刺激的小鼠脾細胞為效應細胞，采用L I ) t t 方法測定E 7 特異性細胞毒性T 淋巴細胞( C T L ) 反應。結(jié)果：( 1 ) 載體構(gòu)建：3 種載體經(jīng)酶切純化后均有預期片斷，p c D N A 一1 6 E 7 、p c D N A 一1 6 M E 7 酶切后均出現(xiàn)2 個片斷，1 ．5 k b ( p c D N A 3 ．1 ) 和3 0 0 b p (

3、 E 7 或M E 7 ) ，p c D N A - V P 2 2 ／E 7 亦出現(xiàn)2 個片斷，1 ．5 k b ( p c D N A 3 ．1 ) 和1 ．2 空白( V P 2 2 ／E 7 融和后的片斷) ，均與預期片斷相同，序列分析證實插入片斷正確。( 2 ) 真核細胞表達：將上述3 種載體轉(zhuǎn)染C O S ．7 細胞，在轉(zhuǎn)染后2 4 小時，3 種載體均出現(xiàn)熒光陽性細胞，但p c D N A - 1 6 M E 7 數(shù)量較少。

4、在轉(zhuǎn)染后4 8 小時，p c D N A ．1 6 M E 7 陽性細胞消失，而其余2 種載體陽性細胞增多。W e s t e r nb l o t 分析，p c D N A 一1 6 M E 7 在轉(zhuǎn)染后2 4 和4 8 小時均未見陽性條帶，而p c D N A ．1 6 E 7 、p c D N A ．1 6 E 7 ／V P 2 2 分別在2 0 k D a 、6 0 k D a 處出現(xiàn)陽性條帶。結(jié)果證實構(gòu)建的2 種表達在真核細胞

5、表達成功，但突變載體表達E 7 蛋白穩(wěn)定性下降，進一步證實E 7c 端鋅指結(jié)合區(qū)對維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)起重要作用。( 3 ) 免疫原性分析：三種疫苗免疫后血清中未檢測到E 7 特異性抗體，統(tǒng)計學上無顯著性差異。不加E 7 特異性多肽組，4 種D N A 疫苗產(chǎn)生L D H 、I L 一2 、I F N —y 的水平無顯著性差異，而加入E 7 特異性多肽組，p c D N A ．1 6 M E 7 、p c D N A —V P 2 2 ／E

6、 7 產(chǎn)生的斑點數(shù)明顯高于p c D N A 一1 6 E 7 和p c D N A 。平均斑點數(shù)分別為3 8 、5 3 、7 和1 。p c D N A 3 ．1 —1 6 M E 7 、p c D N A —V P 2 2 ／E 7 產(chǎn)生的m l F N - y N 顯高于p c D N A 一1 6 E 7 和空載體對照，V P 2 2 ／E 7 產(chǎn)生量最多，是E 7 的3 倍，M E 7 次之，是E 7的2 倍。結(jié)論：2 種D