HPV16E7基因慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、研究背景及目的:
　　 人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)不但是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的重要因素，還與外陰和肛周鱗癌的形成密切相關(guān)。在大約70～100％的肛周鱗癌中可以檢出高危型HPV-DNA。其中，HPV16是最為常見(jiàn)的高危型HPV。HPV16 E7 可參與大多數(shù)宮頸癌和某些特定部位上皮腫瘤尤其是頭頸部和生殖器等部位鱗癌的成瘤過(guò)程。大量臨床病理研究證實(shí)：在口腔癌、乳腺癌、胃癌等人類多種惡性上皮腫瘤中

2、，HPV16 E7的表達(dá)與腫瘤分化低、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后差密切相關(guān)。
　　 基于 HIV 改造產(chǎn)生的慢病毒載體由于與其他載體相比具有可容納較大片段外源性目的基因、轉(zhuǎn)染效率高、將目的基因高效轉(zhuǎn)導(dǎo)、整合入宿主細(xì)胞且維持其長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、安全性較好和可感染非分裂期細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，使其在臨床及科研領(lǐng)域的體內(nèi)、外的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面得到了廣泛的應(yīng)用。
　　 為進(jìn)一步研究HPV16 E7基因的功能，我們構(gòu)建了攜帶HPV16 E7基因的慢病

3、毒表達(dá)載體。
　　 研究方法與結(jié)果:1. 目的基因HPV16 E7的獲取為構(gòu)建攜帶目的基因HPV16 E7的慢病毒表達(dá)載體，我們首先以Caski細(xì)胞TotalRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)而以特異性引物擴(kuò)增出HPV16 E7基因全長(zhǎng)序列。
　　 2.重組體 pLV-3FLAG-E7構(gòu)建及鑒定目的基因與表達(dá)載體各自進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后進(jìn)行膠回收，以T4 連接酶將目的基因連入表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用菌落

4、PCR 鑒定轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性克隆送測(cè)序。測(cè)序無(wú)誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。
　　 3.HPV16 E7 慢病毒顆粒(Lenti-E7)的構(gòu)建以攜帶目的基因的表達(dá)質(zhì)粒pLV-3FLAG-E7、慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒pCD/NL-BH、慢病毒膜蛋白質(zhì)粒pLTR-G 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝出含目的基因的慢病毒顆粒Lenti-E7。
　　 4.病毒顆粒Lenti-E7 滴度測(cè)定以慢病毒滴度測(cè)定試劑盒檢測(cè)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞包裝出Lent

5、i-E7 慢病毒顆粒。根據(jù)系列稀釋P24蛋白標(biāo)準(zhǔn)品450nm OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)Lenti-E7 病毒顆粒P24蛋白450nm OD值測(cè)得該病毒顆粒中P24蛋白濃度，進(jìn)而計(jì)算出病毒顆粒Lenti-E7的滴度為2×108 TU/mL，該滴度已達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)準(zhǔn)。
　　 5. Western Blot 檢測(cè)3FLAG-E7 融合蛋白的表達(dá)為檢測(cè)病毒顆粒Lenti-E7能否成功將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，且目的蛋白能成功表達(dá)，我

6、們以病毒顆粒Lenti-E7 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)Western Blot技術(shù)，以FLAG單克隆抗體檢測(cè)3FLAG-E7 融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示3FLAG-E7 融合蛋白在293T細(xì)胞內(nèi)能成功表達(dá)，進(jìn)而說(shuō)明攜帶HPV16 E7基因的慢病毒顆粒Lenti-E7 已構(gòu)建成功。
　　 研究結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建出攜帶HPV16 E7基因的慢病毒顆粒Lenti-E7，且其滴度達(dá)到了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步研究HPV16 E7