缺氧誘導(dǎo)因子-2α基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、背景及目的: 結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，目前以手術(shù)為主，輔以化療等綜合治療仍是治療結(jié)腸癌的主要手段，但其療效目前處于相對停滯狀態(tài)，因此期待在基礎(chǔ)研究中找到新的突破點(diǎn)，盡快提高療效。缺氧是實(shí)體腫瘤中存在的一種普遍現(xiàn)象，缺氧誘導(dǎo)因子2α（HIF-2α）是腫瘤缺氧應(yīng)答反應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)因子之一，研究表明HIF-2α基因在腫瘤增殖、代謝、轉(zhuǎn)移、血管生成中有重要作用，而HIF-2α的調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不明確。本研究擬構(gòu)建HIF-2α基因R

2、NA干擾慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后篩靶。為進(jìn)一步觀察HIF-2α基因RNAi慢病毒載體在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，深入研究HIF-2α基因在缺氧微環(huán)境中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制做前期的準(zhǔn)備工作。 方法: 1：HIF-2αRNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)HIF-2α基因序列，按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo，通過酶切連接構(gòu)建HIF-2α基因RNA干擾慢病毒載體

3、。然后對HIF-2αRNAi慢病毒載體進(jìn)行DNA測序。 2：HIF-2α過表達(dá)載體的構(gòu)建 從含有HIF-2α的質(zhì)?？寺∧０逯蝎@取HIF-2α，將HIF-2α與目的載體分別進(jìn)行酶切、連接構(gòu)建HIF-2α過表達(dá)質(zhì)粒載體，DNA測序HIF-2α過表達(dá)載體。 3：RNA干擾有效靶點(diǎn)的篩選及鑒定 將構(gòu)建的HIF-2α過表達(dá)載體和攜帶不同RNA干擾靶點(diǎn)序列的HIF-2α基因RNA干擾慢病毒載體，共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的293T