RNA干擾沉默宮頸癌缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α基因的相關(guān)研究.pdf

1、背景與研究目的 實體腫瘤的高速生長必然會導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部血液供應(yīng)的相對不足和氧張力的降低，當(dāng)腫瘤體積大于1mm<'3>時自身血供就不能滿足腫瘤細(xì)胞生長的需要，開始出現(xiàn)缺氧區(qū)域。氧分壓的降低使HIF-l α的羥基被抑制從而被激活，HIF-1α進一步與靶基因的HRE中的增強子結(jié)合，對缺氧作出復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤新血管形成和提高糖酵解數(shù)率。Zhong等研究發(fā)現(xiàn)大部分惡性腫瘤中有HIF-1α的表達，良性腫瘤和正常組織卻無HIF-1 α表

2、達，目前有關(guān)HIF-l α與婦科惡性腫瘤生長和發(fā)展的的相關(guān)基礎(chǔ)研究報道不多，宮頸癌細(xì)胞缺氧條件下血管生成激活機制的研究也尚未見報道，為進行阻斷腫瘤缺氧耐受機制的婦科腫瘤基因治療建立研究平臺，本研究擬檢測包括宮頸癌細(xì)胞在內(nèi)的多種婦科惡性腫瘤細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達及其與缺氧時間和缺氧濃度的相關(guān)性；并將針對HIF-1 α的短發(fā)夾狀小干擾RNA(small hairpin RNA，shRNA)首次轉(zhuǎn)染入宮頸癌HeLa細(xì)胞內(nèi)，在mRNA和蛋

3、白水平檢測是否沉默了細(xì)胞中HIF-1 α基因的表達；HIF-l α表達抑制后對VEGF是如何調(diào)控的；宮頸癌細(xì)胞的凋亡途徑是否受到激活；具體探討它對體外HeLa細(xì)胞株的增殖和凋亡作用。力求為今后進行針對HIF-1 α的婦科腫瘤的基因治療探尋一條新的可行途徑。 方法 1、應(yīng)用Western blot檢測HeLa，Siha，Caski，OVCAR8，SKOV3,PA-1等10種婦科惡性腫瘤細(xì)胞在常氧和缺氧培養(yǎng)24小時后HIF-

4、1α蛋白表達情況。檢測缺氧培養(yǎng)不同時段和不同缺氧程度時HIF-1α蛋白的表達變化和相關(guān)性。了解HIF-1α在缺氧條件下不同細(xì)胞株表現(xiàn)的不同特性。 2、將含針對HIF-1α的shRNA有效序列表達載體和無效干擾序列的表達載體分別轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞株，經(jīng)G41S篩選得到陽性克隆細(xì)胞pSUPER-HIF-1α(有效序列，Si組)和pSUPER-NS(干擾序列，NS組)，再與HeLa細(xì)胞一起分別置于常氧和缺氧箱中培養(yǎng)24小時。用熒光

5、定量PCR、Western blot法或ELISA雙抗體夾心法分別檢測pSUPER-HIF-1 α轉(zhuǎn)染組和無效干擾序列組和未轉(zhuǎn)染缺氧培養(yǎng)對照組的HIF-1a和VEGF的mRNA及蛋白的表達情況，了解HIF-1a基因的沉默效果。 3、用MTT比色法分析檢測三組細(xì)胞缺氧培養(yǎng)下的增殖活性，Hoechst染色法檢測細(xì)胞的凋亡情況。流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞凋亡率和周期分布情況檢測。了解沉默HIF-1α基因后是否激活細(xì)胞的凋亡途徑和影響它的增殖活

6、性，是否達到抑瘤的效果。 結(jié)果 1、Western blot檢測結(jié)果顯示10種婦科惡性腫瘤細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)后都有HIF-1a蛋白明顯的增高表達；HeLa細(xì)胞中HIF-1 a的蛋白表達與缺氧濃度有關(guān)；與缺氧時間無明顯相關(guān)。不同的細(xì)胞缺氧后出現(xiàn)表達高峰不一致。 2、轉(zhuǎn)染pSUPER-HIF-1a(有效序列組)和pSUPER-NS(無效序列組)到腫瘤細(xì)胞后，缺氧24 h，實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)HIF

7、-1a mRNA和VEGFmRNA的表達被抑制，差異顯著(p<0.05)，兩者缺氧24小時mRNA抑制率分別為81.65％和67.78％。和pSUPER-NS(無效序列組)和對照組相比蛋白表達也明顯下調(diào)，缺氧72小時時HIF-1a和VEGF蛋白的表達被抑制率為74.43％和 66.18％。證實轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)的pSUPER—HIF-1 α有效地沉默了HIF-1 α基因，HIF-1 α對VEGF在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都有調(diào)控作用。 3、與對

8、照組比較，Hela細(xì)胞的HIF-1 α轉(zhuǎn)染組在缺氧狀態(tài)下增殖活性降低，明顯低于干擾序列轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組；Hoechst法熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，缺氧72小時后，pSUPER—HIF-1 α(有效序列組)細(xì)胞中可見較多凋亡小體；流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，厭氧72 h時細(xì)胞凋亡率最高，達23.5％，明顯高于對照組(p<0.05)；細(xì)胞周期分析顯示G1期細(xì)胞比例明顯增多，S期細(xì)胞比例明顯降低；有氧培養(yǎng)下各組檢測值無顯著差別，轉(zhuǎn)染無效序列組和對照組之

9、間無統(tǒng)計學(xué)差異。pSUPER—HIF-1 α轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后可促進細(xì)胞的凋亡和阻抑細(xì)胞的增殖活性。 結(jié)論 與大多數(shù)實體腫瘤細(xì)胞一樣，婦科腫瘤細(xì)胞中也存在缺氧耐受的分子機制。在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，HIF-1 α在VEGF的低氧誘導(dǎo)途徑中充當(dāng)著決定性的調(diào)控作用。HIF-1 α shRNA表達載體能特異、高效地抑制宮頸癌Hela細(xì)胞HIF-1 α基因的表達，作用時間至可維持至抗性克隆形成后4周。特異性針對HIF-1 α的小干擾可