靶向缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1的抗腫瘤藥物篩選的分子模型建立.pdf

1、腫瘤細(xì)胞的迅速增殖和腫瘤內(nèi)部新生血管的紊亂使得缺氧成為實(shí)體瘤物理微環(huán)境的基本特征之一。越來(lái)越多的證據(jù)表明缺氧是決定惡性腫瘤預(yù)后的重要因素。缺氧不僅可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐受性，更重要的是缺氧還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的發(fā)生。缺氧調(diào)控的一系列基因和蛋白的表達(dá)正是這些現(xiàn)象發(fā)生的根本原因。缺氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxia Inducible Factor 1，HIF-1)是調(diào)控腫瘤缺氧效應(yīng)的一類極為重要的轉(zhuǎn)錄因

2、子。 HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體蛋白。β亞基在胞內(nèi)的蛋白水平不受氧水平的影響，而HIF-1α在常氧條件下一經(jīng)翻譯即發(fā)生O2依賴的羥基化，進(jìn)而經(jīng)由pVHL的介導(dǎo)而被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)迅速降解(半衰期小于5min)；在缺氧條件下HiF-1由于不能發(fā)生自身的羥基化而能得以穩(wěn)定，進(jìn)而轉(zhuǎn)入核內(nèi)并與HI F-β合形成HIF-1蛋白復(fù)合物,HIF-1通過(guò)與其靶基因上的缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia responsib

3、le element，HRE)的結(jié)合而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控諸如腫瘤血管生成、糖類代謝等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。以HIF-1為靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤藥物的開發(fā)也引起了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。HIF-1的激活涉及了胞內(nèi)眾多的信號(hào)通路，而且HIF-1α蛋白本身存在諸如羥基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化等多種修飾，人們?cè)谶^(guò)去十多年中所發(fā)現(xiàn)的HIF-1的抑制劑多為非特異性的化合物，因此開發(fā)能夠特異性的抑制HIF-1的藥物成為當(dāng)

4、前該領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。 本論文研究的目的就是擬在體外表達(dá)HIF-1α和HIF-1β的蛋白結(jié)合區(qū)(bHLH/PAS domain)并人工合成HRE(5’-GTGCTACGTGCTGCCCTG-3’)序列，建立能夠用于篩選特異性抑制HIF-1與其靶基因結(jié)合的新的抗腫瘤藥物的分子模型，并對(duì)該模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。 第一部分：HIF-1α和HIF-1β的蛋白結(jié)合區(qū)表達(dá)載體的構(gòu)建 本部分實(shí)驗(yàn)首先用RT-RNA的方法從人乳腺癌細(xì)胞46

5、8的cDNA中擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的HIF-1α和HIF-1β的蛋白結(jié)合區(qū)cDNA，然后通過(guò)酶切連接將擴(kuò)增片斷連入pFastBac HTb載體中，經(jīng)過(guò)雙酶切和測(cè)序選取連接正確的克隆。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白班篩選挑取陽(yáng)性克隆。抽提質(zhì)粒以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 第二部分：HIF-1α和HIF-1β的蛋白結(jié)合區(qū)的表達(dá)、純化和鑒定 本部分實(shí)驗(yàn)主要是利用Invitrogen公司的Bac-to-Bac Baculo

6、viruse Expression System進(jìn)行了蛋白表達(dá)，然后用Ni-NTA柱對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。再用考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot方法對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：得到了HIF-1α和HIF-1β的蛋白結(jié)合區(qū)重組蛋白，分別命名HIF-1α-RP和HIF-1β-RP。 第三部分：HIF-1α-RP和HIF-1β-RP活性分析和ELISA分子模型的建立 為了檢測(cè)重組蛋白的活性我們分別在體外合成了野生

7、HRE序列(wtHRE，5’-GTGCTACGTGCTGCCCTG-3’)和突變了HIF-1結(jié)合位點(diǎn)的突變HRE序列(mtHRE，5’-GTGCTAAAAGCTGCCCTG-3’)并對(duì)合成的野生HRE序列進(jìn)行了3’端生物素標(biāo)記，然后利用EMSA方法來(lái)鑒定重組蛋白復(fù)合物和HRE序列的結(jié)合能力。隨后建立了可用于篩選化合物的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的分子模型，并引入陽(yáng)性化合物棘霉素對(duì)建立的分子模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲得的重組蛋白能夠