HIF-1在缺氧誘導胃癌MDR中的機制研究.pdf

1、缺氧是實體瘤中普遍存在的現(xiàn)象，可以誘發(fā)腫瘤細胞對化療藥物的抵抗，是實體瘤患者化療失敗最重要的原因之一。缺氧誘導腫瘤細胞耐藥是一個非常復雜的過程，有多種分子的參與，盡管目前對缺氧誘導耐藥的研究已進行多年，但仍未發(fā)現(xiàn)行之有效的逆轉方法。這是由于其分子機制仍未完全闡明，更重要的是未能找到諸多耐藥相關基因的上游調(diào)控分子。因此，闡明其分子機制并尋找從缺氧發(fā)生到出現(xiàn)耐藥表型形成過程中的關鍵分子，將其作為靶點來逆轉實體瘤耐藥，將為治療腫瘤開辟新的道路

2、。近年來，有研究報道提示缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)可能是缺氧誘導實體瘤多藥耐藥的一個關鍵分子。因此，深入探討HIF-1 在缺氧誘導胃癌多藥耐藥中的作用及其分子機制，將有助于全面深入地理解缺氧誘導胃癌MDR 發(fā)生的過程和調(diào)節(jié)機制。 目的： 研究缺氧條件下胃癌細胞對于多種化療藥物的耐受性，檢測缺氧條件下胃癌細胞中HIF-1 的表達以及缺氧誘導HIF-1 的上游信號通路

3、；構建HIF-1表達上調(diào)和下調(diào)的胃癌細胞亞系，研究HIF-1 在缺氧誘導胃癌MDR 中的作用；并進一步探討HIF-1 轉錄調(diào)控的下游的耐藥相關分子的表達和調(diào)控機制，第四軍醫(yī)大學博士學位論文進一步明確HIF-1 在缺氧誘導腫瘤細胞耐藥中的作用機制；以HIF-1 為靶點進行體內(nèi)藥物逆轉實驗，為HIF-1 作為逆轉缺氧條件下實體瘤MDR 的增敏劑提供實驗依據(jù)。 方法： 1. 通過MTT 比色法、Annexin V/PI 染色

4、法和阿霉素潴留和蓄積試驗檢測缺氧和常氧狀態(tài)下胃癌細胞對于不同化療藥物的藥物敏感性； 2.利用Western blot 和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測缺氧誘導胃癌細胞HIF-1 的蛋白表達和轉錄活性； 3. 利用半定量RT-PCR 和ELISA 方法檢測缺氧誘導下的VEGF 的mRNA 和蛋白表達； 4. 利用Western blot 和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測缺氧條件下磷酸化AKT、p42/44 MAPK(

5、ERK1/2) 水平，以及使用PI3K特異性抑制劑LY294002（5、10 μM）和MEK 特異性抑制劑U0126 (1、10μM）后其下游激酶AKT 和p42/44 MAPK(ERK1/2) 的磷酸化水平的變化以及HIF-1 表達和轉錄活性的變化； 5. 利用半定量RT-PCR、ELISA 和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測缺氧條件下使用PI3K 特異性抑制劑LY294002（5、10μM）和MEK 特異性抑制劑U0126 (1

6、、10μM）后VEGF 的mRNA、蛋白表達以及EPO 的熒光素酶活性； 6. 通過MTT 比色法檢測HIF-1 上調(diào)和HIF-1下調(diào)的胃癌細胞在常氧和缺氧條件下對于不同化療藥物的敏感性；通過Annexin V/PI 染色法檢測HIF-1 上調(diào)和HIF-1 下調(diào)的胃癌細胞系對于化療藥物誘導的凋亡的影響，并計算凋亡指數(shù)；借助流式細胞儀（FCM）檢測HIF-1上調(diào)和HIF-1 下調(diào)的胃癌細胞系內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留，并計算相應的藥物

7、泵出率； 7. 利用RT-PCR 和Western blot 方法檢測缺氧條件下以及轉染HIF-1正義表達載體和小干擾RNA 載體的細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax 和MGr1-Ag 的表達水平； 8. 利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、染色質免疫共沉淀、電泳遷移率試驗檢測HIF-1 對MGr1-Ag 轉錄調(diào)控機制； 9. 通過細胞黏附實驗、MTT 比色法和Annexin V/PI 染色法檢測轉染MG

8、r1-Ag siRNA 的胃癌細胞在缺氧條件下的細胞黏附狀態(tài)以及對于不同化療的藥物敏感性及凋亡指數(shù)的變化； 10. 通過構建人胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR 的裸鼠移植瘤模型，觀察以HIF-1 為靶點的小干擾RNA 對于SGC7901/VCR 耐藥性的體內(nèi)逆轉效果；通過免疫組織化學的方法，檢測各處理組移植瘤內(nèi)HIF-1 的表達水平。 通過Western Blot 檢測各處理組移植瘤內(nèi)HIF-1 的蛋白表達。

9、 結果： 1. 與常氧狀態(tài)細胞相比，缺氧能夠降低胃癌細胞對于不同化療藥物的敏感性，減少化療藥物誘導的凋亡和細胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留（p<0.05）； 2.缺氧能夠誘導不同胃癌細胞系HIF-1 的蛋白和轉錄活性，且呈時間依賴性的增加。缺氧還能夠誘導不同的胃癌細胞系中HIF-1 的下游靶基因VEGF 的mRNA 和蛋白水平以及EPO 的熒光素酶活性； 3. 缺氧能夠誘導胃癌細胞系中磷酸化AKT、p42/44M

10、APK(ERK1/2)的表達； 4. PI3K 和MEK的抑制劑LY294002 和U0126 能夠抑制缺氧誘導的磷酸化AKT 和ERK1/2表達，進而抑制了HIF-1 的表達和活性； 5. LY294002 和U0126 抑制缺氧誘導的VEGF 的mRNA 和蛋白水平以及EPO 的熒光素酶活性； 6. 與對照細胞相比，轉染正義HIF-1 表達載體的胃癌細胞對于不同化療藥物的敏感性明顯降低，化療藥物誘導的凋

11、亡指數(shù)明顯減少，轉染細胞內(nèi)Bcl-2 的表達顯著增強，Bax 表達顯著減弱；細胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留均明顯減少，細胞內(nèi)P-gp、MRP 的表達明顯增加（p<0.05）。轉染HIF-1siRNA 細胞能夠明顯逆轉缺氧誘導的化療藥物的抵抗，化療藥物誘導的凋亡指數(shù)明顯增加，Bcl-2 的表達顯著減弱，Bax 表達顯著增強，細胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留均明顯增加，細胞內(nèi)P-gp、MRP 的表達明顯降低（p<0.05）； 7. 缺氧能夠上調(diào)

12、MGr1-Ag的表達，抑制HIF-1 的表達能夠明顯抑制缺氧誘導的MGr1-Ag 的mRNA 和蛋白水平； 8. 在MGr1-Ag 啟動子區(qū)域的轉錄起始位點的上游-16 的區(qū)域有HIF-1 的缺氧反應元件的結合序列5’-ACGTG-3’，HIF-1 能夠與該元件結合從而發(fā)揮其轉錄調(diào)控的功能； 9. 缺氧能夠顯著增強胃癌細胞黏附與基質的能力，而轉染了MGr1-Ag siRNA 的胃癌細胞的黏附能力顯著下降。與對照細胞相

13、比，轉染了MGr1-Ag siRNA 的胃癌細胞能夠逆轉缺氧所致的化療藥物耐受和增加化療藥物誘導的凋亡。 10. 與各種對照組相比，以HIF-1 為靶點的小干擾RNA可以明顯增強人胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR 的裸鼠移植瘤對于長春新堿的敏感性，移植瘤體積顯著減?。╬<0.05），移植瘤組織內(nèi)HIF-1 的表達下降，Western Blot 結果顯示，移植瘤內(nèi)HIF-1 表達水平明顯下調(diào)（p<0.05）。 結論：

14、 1.缺氧能夠顯著降低化療藥物的敏感性； 2.胃癌細胞在缺氧條件下，通過活化PI3K/AKT 和MEK-p42/44MAPK(ERK1/2) 信號通路途徑介導了HIF-1 的穩(wěn)定表達和轉錄活化，并進而增強了對于化療藥物的耐受性； 3.缺氧誘導的HIF-1 依賴性MDR是通過上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)Bax 降低化療藥物誘導的凋亡，以及通過上調(diào)p-gp 和MRP 的表達而減少了化療藥物在細胞內(nèi)的潴留和蓄積來實現(xiàn)的；