骨肉瘤中缺氧誘導(dǎo)HIF-1α調(diào)控乳酸脫氫酶-A的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　明確骨肉瘤細(xì)胞缺氧條件下HIF-1α調(diào)控乳酸脫氫酶-A的分子機(jī)制及乳酸脫氫酶-A對(duì)骨肉瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1.免疫組化分析18例臨床標(biāo)本，確認(rèn)乳酸脫氫酶-A在骨肉瘤患者中的表達(dá)情況；
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞在常氧條與缺氧條件下乳酸脫氫酶-A的表達(dá)情況。蛋白印記法檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞系MG3細(xì)胞在常氧條與缺氧條件下乳酸脫氫酶-A及HIF-1蛋白水平

2、的表達(dá)情況。
　　3．構(gòu)建含有乳酸脫氫酶-A啟動(dòng)子區(qū)的螢光素酶報(bào)告載體，通過(guò)免疫熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MC63細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)表達(dá)的內(nèi)源性HIF-1是否對(duì)乳酸脫氫酶-A具有調(diào)控作用，并進(jìn)一步明確HIF-1對(duì)乳酸脫氫酶-A的調(diào)控位點(diǎn)；常氧下轉(zhuǎn)染HIF-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，觀察外源性HIF-1的表達(dá)對(duì)乳酸脫氫酶-A的調(diào)控作用及位點(diǎn)。
　　4．構(gòu)建HIF-1敲除質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，對(duì)比常氧條件與缺氧條件下，敲除HIF-1后是否能有效抑制乳

3、酸脫氫酶-A的表達(dá)，從而進(jìn)一步反正HIF-1對(duì)乳酸脫氫酶-A的調(diào)控。
　　5．構(gòu)建乳酸脫氫酶-A敲除質(zhì)粒，缺氧條件下培養(yǎng)MG63細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察敲除乳酸脫氫酶-A對(duì) MG63細(xì)胞的遷移能力的影響。
　　6．通過(guò)細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)缺氧條件下敲除乳酸脫氫酶-A后，MG63細(xì)胞的細(xì)胞活力及增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1.乳酸脫氫酶-A在大多數(shù)骨肉臨床樣本中高表達(dá)，在檢測(cè)的18例臨床樣本中，4例弱陽(yáng)性、8

4、呈陽(yáng)性、6例呈強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)80％；
　　2.缺氧條件下，RT-PCR檢測(cè)MG63細(xì)胞中乳酸脫氫酶-A表達(dá)明顯上調(diào)，與常氧條件相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；
　　3.通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件下HIF-1可誘導(dǎo)乳酸脫氫酶-A的表達(dá)，其調(diào)控關(guān)系主要通過(guò)結(jié)合乳酸脫氫酶-A啟動(dòng)子區(qū)的缺氧誘導(dǎo)元件-D介導(dǎo)。
　　4.通過(guò)RNA干擾技術(shù)，缺氧條件下敲除HIF-1α后，明顯的抑制了缺氧對(duì)乳酸脫氫酶-A表達(dá)

5、的誘導(dǎo)；
　　5.通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件下MG63細(xì)胞敲除乳酸脫氫酶-A后，能明顯抑制其遷移能力；
　　6.通過(guò)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，缺氧條件下MG63細(xì)胞敲除乳酸脫氫酶-A后，其增殖能力受到一定程度的抑制，與未敲除組比較不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中，腫瘤內(nèi)部常處于缺氧狀態(tài)，缺氧的微環(huán)境下HIF-1表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)與乳酸脫氫酶A啟動(dòng)子區(qū)的缺氧誘導(dǎo)原件-D結(jié)合激活其表達(dá)。同時(shí)，我們還