骨肉瘤干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制及意義.pdf

1、文重點(diǎn)探索了TSSC3基因、Notch通路及血管內(nèi)皮細(xì)胞對OSC自我更新能力的影響和機(jī)制。本文采用體外基因過表達(dá)和敲低技術(shù)、PCR、Western-blot、皮下移植瘤和顱內(nèi)移植瘤模型、臨床病理資料分析、免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell雙室共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，分別在第一部分研究了印跡基因TSSC3、Nanog在維持OSC干性表型中的作用，并在第二部分初步篩選了Notch通路眾多相關(guān)分子中有可能影響OSC的配體和受體，

2、以及在內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境中的作用。主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下：
　　一、TSSC3可通過Src/Akt抑制Nanog表達(dá)并抑制OSC干性表型
　　1.TSSC3可以抑制OSC干性表型
　　通過免疫組化方法、RT-PCR、Western-blot方法、成球培養(yǎng)方法、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法得到以下結(jié)果:
　　1.1高表達(dá)TSSC3的患者預(yù)后在總生存期(OS)和無病生存期(PFS)都遠(yuǎn)好于低表達(dá)TSSC3的患者(P＜

3、0.05);TSSC3基因具有提示腫瘤復(fù)發(fā)潛能的作用，在復(fù)發(fā)VS未復(fù)發(fā)的病人中陽性比例是1/15 VS9/26，P＜0.05。
　　1.2利用成球培養(yǎng)的方法富集不同骨肉瘤細(xì)胞株(MTH、SaoS2)的OSC，干性相關(guān)核蛋白(Nanog、Sox2、Oct4)表達(dá)的升高;且在OSC中TSSC3表達(dá)明顯降低。
　　1.3通過在不同骨肉瘤細(xì)胞系中建立TSSC3過表達(dá)模型，檢測到過表達(dá)TSSC3后Nanog的表達(dá)顯著降低，同時(shí)骨肉瘤細(xì)

4、胞系的體外成球能力和成球體積都有明顯下降（MTH細(xì)胞在5個(gè)/孔濃度下平均每個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生0.44±0.09個(gè)細(xì)胞球VS0.23±0.02個(gè)，P＜0.05;SaOS2細(xì)胞在5個(gè)/孔濃度下平均每個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生0.42±0.18個(gè)細(xì)胞球VS0.34±0.07個(gè)，P＜0.05），干性表面標(biāo)記CD133、CD117、Stro1表達(dá)也明顯下降(P＜0.05)。
　　2.過表達(dá)Nanog可以增強(qiáng)OSC干性表型
　　通過免疫組化方法、成球培養(yǎng)方

5、法、流式細(xì)胞術(shù)、裸鼠成瘤能力實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、化療抵抗實(shí)驗(yàn)等方法得到以下結(jié)果:
　　2.1高表達(dá)Nanog和發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者有強(qiáng)相關(guān)性，在發(fā)生轉(zhuǎn)移VS未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中Nanog的陽性表達(dá)比例為7/12 VS9/29，P＜0.05;高表達(dá)Nanog的患者的總生存期和無病生存期均明顯延長(P＜0.05)。
　　2.2在過表達(dá)TSSC3的細(xì)胞模型上再次過表達(dá)了Nanog，檢測到過表達(dá)Nanog后其體

6、外成球能力和成球體積都有顯著增強(qiáng)。（MTH細(xì)胞在5個(gè)/孔濃度下平均每個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生0.45±0.05個(gè)細(xì)胞球VS0.83±0.12個(gè)，P＜0.05; SaOS2細(xì)胞在5個(gè)/孔濃度下平均每個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生0.35±0.13個(gè)細(xì)胞球VS0.78±0.23個(gè)，P＜0.05）。過表達(dá)TSSC3的骨肉瘤細(xì)胞系的裸鼠成瘤能力明顯降低，再次過表達(dá)Nanog后其成瘤能力再次增強(qiáng)，MTH細(xì)胞成瘤數(shù)在每個(gè)注射點(diǎn)10000個(gè)細(xì)胞時(shí)為3/5 VS2/5 VS5/5，

7、每個(gè)注射點(diǎn)1000個(gè)細(xì)胞時(shí)為2/5 VS1/5 VS5/5; SaOS2細(xì)胞成瘤數(shù)在每個(gè)注射點(diǎn)40000個(gè)細(xì)胞時(shí)為4/5 VS4/5 VS5/5，每個(gè)注射點(diǎn)4000個(gè)細(xì)胞時(shí)為3/5 VS1/5 VS4/5。
　　2.3過表達(dá)Nanog的骨肉瘤細(xì)胞系的侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，并且在順鉑的化療抵抗實(shí)驗(yàn)中其化療抵抗能力增強(qiáng)，通過劑量依賴曲線發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Nanog后順鉑的IC50值也有很明顯升高。
　　3.敲低Nano

8、g的骨肉瘤細(xì)胞系的干性表型明顯下降。
　　通過成球培養(yǎng)方法、裸鼠成瘤能力實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、化療抵抗實(shí)驗(yàn)等方法得到以下結(jié)果:
　　3.1極限稀釋法發(fā)現(xiàn)敲低Nanog后的骨肉瘤細(xì)胞系其體外成球能力和成球體積都有顯著降低（MTH細(xì)胞敲低Nanog后在5個(gè)/孔濃度下平均每個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生細(xì)胞球數(shù)為0.83±0.28 VS0.28±0.22和0.68±0.21個(gè)，P＜0.05; SaOS2細(xì)胞敲低Nanog后在5

9、個(gè)/孔濃度下平均每個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生細(xì)胞球數(shù)為0.78±0.24 VS0.52±0.23，0.37±0.25個(gè)，P＜0.05）。敲低Nanog后的MTH細(xì)胞成瘤數(shù)在每個(gè)注射點(diǎn)40000個(gè)細(xì)胞時(shí)為5/5 VS3/5，每個(gè)注射點(diǎn)4000個(gè)細(xì)胞時(shí)為4/5 VS2/5; SaOS2細(xì)胞成瘤數(shù)在每個(gè)注射點(diǎn)40000個(gè)細(xì)胞時(shí)為5/5 VS4/5，每個(gè)注射點(diǎn)4000個(gè)細(xì)胞時(shí)為4/5 VS2/5。
　　3.2劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低

10、Nanog的骨肉瘤細(xì)胞系的侵襲、遷移能力明顯減弱(P＜0.05)。在順鉑的化療抵抗實(shí)驗(yàn)中其化療抵抗能力也有減弱，通過劑量依賴曲線發(fā)現(xiàn)敲低Nanog后順鉑的IC50值也有很明顯下降。
　　4.Src介導(dǎo)了TSSC3敲低Nanog的作用
　　通過成球培養(yǎng)方法、PT-PCR、Western-blot、藥物抑制實(shí)驗(yàn)、siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等方法得到以下結(jié)果:
　　4.1在過表達(dá)TSSC3的細(xì)胞系中檢測了p-Src和p-

11、Akt的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)伴隨著TSSC3的上調(diào)，p-Src和p-Akt的表達(dá)發(fā)生了下調(diào)。利用Src抑制劑PP2抑制Src通路活性，檢測到Nanog的表達(dá)下降(P＜0.05）。
　　4.2利用Src siRNA和Lv-TSSC3進(jìn)行同時(shí)處理，檢測Nanog的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)敲低Src后可以抑制Nanog表達(dá)(P＜0.05），在此基礎(chǔ)上過表達(dá)TSSC3無法進(jìn)一步抑制Nanog表達(dá)（P＞0.05）。敲低Src后可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的體外成球數(shù)

12、量和成球體積以及干性表面標(biāo)記的表達(dá)(P＜0.05)，在此基礎(chǔ)上過表達(dá)TSSC3后無法進(jìn)一步抑制體外成球能力和干性表面標(biāo)記的表達(dá)。
　　5.Akt通路介導(dǎo)了TSSC3敲低Nanog的作用
　　通過成球培養(yǎng)方法、PT-PCR、Western-blot、藥物抑制與刺激實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等方法得到以下結(jié)果:
　　5.1p-Src和p-Akt的表達(dá)在干細(xì)胞中的表達(dá)相對于對應(yīng)的單層貼壁細(xì)胞中都明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。利用Akt抑制

13、劑LY294002對細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)抑制Akt磷酸化活性可以抑制Nanog表達(dá)(P＜0.05)。
　　5.2利用Akt通路激活劑IGF1和Lv-TSSC3進(jìn)行同時(shí)處理，發(fā)現(xiàn)Akt激活后可以明顯增強(qiáng)Nanog表達(dá)，而過表達(dá)TSSC3后再激活A(yù)kt通路可以回復(fù)Nanog的表達(dá)。在IGF1和Lv-TSSC3同時(shí)分組處理時(shí)，Akt激活后可以明顯增強(qiáng)體外成球數(shù)量和成球體積以及干性表面標(biāo)記的表達(dá)，而過表達(dá)TSSC3后再激活A(yù)kt通路可

14、以回復(fù)體外成球能力和干性表面標(biāo)記表達(dá)。
　　6.各分子表達(dá)與骨肉瘤病人臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系
　　通過免疫組化方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)得到了以下結(jié)果:p-Src高表達(dá)與骨肉瘤病人總生存期和無病生存期較短有極強(qiáng)的聯(lián)系(P＜0.05)，而p-Akt表達(dá)與骨肉瘤病人預(yù)后沒有明顯聯(lián)系，P＞0.05。在臨床標(biāo)本上p-Src表達(dá)與p-Akt表達(dá)有明顯正相關(guān)(P＜0.05)，p-Src表達(dá)與Nanog表達(dá)有明顯正相關(guān)(P＜0.05)。p-

15、Src表達(dá)量與病人轉(zhuǎn)移率正相關(guān)（發(fā)生轉(zhuǎn)移VS未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的p-Src陽性比例為7/12 VS8/29，P＜0.05），也與截肢手術(shù)采用率正相關(guān)（采用截肢手術(shù)VS采用局部切除手術(shù)的患者p-Src陽性比例為11/20 VS4/21，P＜0.05），而Akt通路與以上參數(shù)沒有明顯聯(lián)系。
　　二、Notch通路和內(nèi)皮細(xì)胞在維持OSC干性中發(fā)揮作用。
　　1.通過成球培養(yǎng)法建立了U2OS的細(xì)胞球模型
　　通過RT-PCR和W

16、estern-blot實(shí)驗(yàn)檢測到U2OS細(xì)胞球中的干性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog的表達(dá)相比相應(yīng)的貼壁細(xì)胞都有明顯增高(P＜0.05)，而Sox2在U2OS中表達(dá)量較低，沒有明確趨勢。
　　2.Hes1是Notch通路在OSC中起作用的效應(yīng)分子
　　通過RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Notch通路的兩個(gè)重要下游效應(yīng)分子Hes1、Hey1的表達(dá)，在三種細(xì)胞系的細(xì)胞球中都有明顯上調(diào)(P＜0.05);但是Hey1

17、在蛋白水平并不能很明確的檢測到。
　　3.DLL4是Notch通路在OSC中起作用的配體之一
　　RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測了Notch通路的眾多配體在干細(xì)胞和貼壁細(xì)胞中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)其中DLL4的表達(dá)上調(diào)最為明顯(P＜0.05)，并且在三種干細(xì)胞球中都表現(xiàn)一致。
　　4.Notch3是Notch通路在OSC中起作用的受體之一
　　RT-PCR、Western-blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析了四