LY294002對(duì)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　1.研究無(wú)血清培養(yǎng)法和免疫磁珠分選法用于人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng),探討兩者作為分選方法的可行性。
　　2.研究Nanog在人骨肉瘤及其類腫瘤干細(xì)胞的中的表達(dá)及意義。
　　3.研究LY294002對(duì)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響,并初步探討其抑制增殖作用可能的機(jī)制。
　　4.研究LY294002對(duì)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞凋亡的影響,并初步探討其誘導(dǎo)凋亡作用可能的機(jī)制。
　　方法:

2、>　　1.無(wú)血清培養(yǎng)法分離人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞;免疫磁珠分選CD133+CD44+人骨肉瘤細(xì)胞;免疫組織化學(xué)法鑒定人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞CD44和CD133的表達(dá)情況;蛋白印跡法檢測(cè)骨肉瘤及其類腫瘤干細(xì)胞Nanog的表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:LY294002在培養(yǎng)基中的濃度分別為0μmol/L(對(duì)照組)、5μmol/L、15μmol/L和45μmol/L。
　　3.CCK-8法檢測(cè)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞在不同LY

3、294002濃度下的增殖情況;碘化丙啶PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞在不同LY294002濃度下細(xì)胞周期的變化;蛋白印跡法法檢測(cè)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞在不同LY294002濃度下總AKT、磷酸化AKT和β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)情況。
　　4.AnnexinV/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞在不同LY294002濃度下的凋亡情況;蛋白印跡法檢測(cè)半胱天冬酶-3、活化型半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9、活化型聚腺苷二磷酸

4、核糖聚合酶和β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.采用無(wú)血清培養(yǎng)法可以從人骨肉瘤MG63細(xì)胞中分離出成“細(xì)胞球”生長(zhǎng)的人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞;采用免疫磁珠法可以從人骨肉瘤MG63細(xì)胞中分離出CD133+CD44+人骨肉瘤細(xì)胞,該細(xì)胞亦可在含表皮生長(zhǎng)因子和成纖維生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中形成“細(xì)胞球”;將上述骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞球傳代于無(wú)血清培養(yǎng)基仍可形成相似的人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞球;人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞CD44和CD133

5、均呈陽(yáng)性表達(dá);人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞Nanog表達(dá)水平強(qiáng)于人骨肉瘤MG63細(xì)胞(P<0.05)。
　　2.與對(duì)照組相比較,無(wú)論何種濃度的LY294002均對(duì)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用,且其抑制作用與劑量有一定的相關(guān)性;各干預(yù)組與對(duì)照組比較人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞中G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增多(P<0.01),增殖指數(shù)明顯減低(P<0.01);隨著LY294002濃度的不斷增加,人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞中的pAKT表達(dá)量逐漸

6、下降。
　　3.隨著LY294002濃度的逐漸增加,各干預(yù)組活細(xì)胞有所下降,而凋亡有所增加,這種對(duì)凋亡的促進(jìn)作用同樣表達(dá)出一定的劑量依賴性,其中45μmol/L組最為明顯(P<0.01);在對(duì)照組和干預(yù)組中均可以檢測(cè)到半胱天冬酶-3的表達(dá),但是活化型半胱天冬酶-3只有在干預(yù)組中才能觀察到明顯的表達(dá),且活化型半胱天冬酶-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的表達(dá)量隨LY294002濃度的增高也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　1.無(wú)

7、血清培養(yǎng)法可以用于人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞的分離和培養(yǎng);Nanog作為維持細(xì)胞多能性的關(guān)鍵蛋白,可能成為分離和鑒定人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志之一。
　　2.LY294002對(duì)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)增殖的抑制作用,該作用可能是通過(guò)其抑制PI3K而導(dǎo)致其下游AKT活性減弱,細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯所介導(dǎo)的。
　　3.LY294002對(duì)人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)凋亡的促進(jìn)作用,該作用可能是通過(guò)其抑制PI3K導(dǎo)致其下游A