DATS和辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 DATS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　1.觀察DATS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用。
　　2.探尋DATS抑制骨肉瘤生長的可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用不同濃度的DATS處理骨肉瘤細(xì)胞MG63和MNNG/HOS24h，48h，72h后，用CCK-8法檢測骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞活性，分析DATS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　2.應(yīng)用不同濃度D

2、ATS孵育MG63和MNNG/HOS細(xì)胞48h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，觀察DATS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響。
　　3.應(yīng)用細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測DATS處理骨肉瘤細(xì)胞MG63和MNNG/HOS后的細(xì)胞周期分布變化，觀察DATS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期分布的影響。應(yīng)用Western Blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、p21、p27的表達(dá)，分析DATS誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞G0/G1周期阻滯的可能分子機(jī)制。
　　4.

3、應(yīng)用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測DATS處理骨肉瘤細(xì)胞MG63和MNNG/HOS后的細(xì)胞細(xì)胞凋亡比率，觀察DATS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.應(yīng)用熒光探針DCFH-DA通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測DATS誘導(dǎo)MG63和MNNG/HOS細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)變化水平。
　　6.應(yīng)用熒光探針JC-1檢測DATS處理后的骨肉瘤細(xì)胞MG63和MNNG/HOS的線粒體膜電位變化。
　　7.DATS處理MG63和MNNG/HOS

4、細(xì)胞后，提取總蛋白，應(yīng)用Western Blot檢測PI3K/Akt信號(hào)通路中PI3Kp110β、PI3Kp85α、Akt、phosoho-Akt的表達(dá)及下游分子Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)，檢測線粒體凋亡通路中cytochrome c、caspase-9、caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)變化。分析DATS誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.DATS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG6

5、3和MNNG/HOS的活性抑制作用隨藥物濃度和處理時(shí)間的增加而增強(qiáng)。DATS對(duì)MG63細(xì)胞活性有著更強(qiáng)的抑制作用。
　　2.DATS處理細(xì)胞48h后，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化。
　　3.DATS誘導(dǎo)MG63和MNNG/HOS細(xì)胞發(fā)生G0/G1周期阻滯，抗氧化劑NAC能夠逆轉(zhuǎn)DATS誘導(dǎo)的G0/G1周期阻滯。DATS處理骨肉瘤細(xì)胞后cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，而p21和p27蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　4.DA

6、TS能以劑量和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。NAC預(yù)處理細(xì)胞后可逆轉(zhuǎn)DATS誘導(dǎo)的凋亡。
　　5.DATS作用MG63和MNNG/HOS16h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加。DATS隨著濃度增加和作用時(shí)間延長而明顯增加骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平。NAC則完全消除了ROS的增加。
　　6.DATS作用骨肉瘤細(xì)胞后，線粒體膜電位水平發(fā)生明顯下降，NAC對(duì)抗DATS對(duì)線粒體膜電位的破壞作用。
　　7.DATS作用后骨肉瘤細(xì)

7、胞內(nèi)PI3Kp110β，PI3Kp85α，Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)與劑量相關(guān)的下降。同時(shí)Bad和Bax表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2和Bcl-XL表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)cytochrome c及活化的caspase-9和caspase-3水平，cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯增加。說明DATS通過下調(diào)PI3K/Akt通路和激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，DATS對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路起到了PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY

8、294002的類似作用，而LY294002和DATS共同處理細(xì)胞時(shí)起到了明顯的協(xié)同抑制作用。NAC完全逆轉(zhuǎn)DATS對(duì)PI3K/Akt通路蛋白的下調(diào)，說明DATS誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞MG63和MNNG/HOS凋亡是依賴于ROS增加導(dǎo)致的PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)起作用的。
　　結(jié)論：
　　1.DATS具有明顯的抑制骨肉瘤細(xì)胞生長的作用。
　　2.DATS通過增加ROS的產(chǎn)生及下調(diào)cyclin D1、上調(diào)p21和p27蛋白表

9、達(dá)而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞G0/G1周期阻滯。
　　3.DATS通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞線粒體膜電位水平下降。
　　4.DATS通過增加ROS增加誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制可能與ROS依賴的PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)及線粒體凋亡通路活化有關(guān)。
　　第二部 分辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　1.觀察辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用。
　　2.探尋辛伐他汀抑制骨肉瘤生長的可能信號(hào)通路

10、及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用不同濃度的辛伐他汀處理骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS24h，48h，72h后，用CCK-8法檢測骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞活性，分析辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　2.應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（愈傷實(shí)驗(yàn)）檢測辛伐他汀處理骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS后的細(xì)胞遷移距離，觀察辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力影響。
　　3.應(yīng)用底面鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室檢測辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵

11、襲能力的影響。應(yīng)用Western Blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)，分析辛伐他汀抑制抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移侵襲的可能分子機(jī)制。
　　4.應(yīng)用細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測辛伐他汀處理骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS后的細(xì)胞周期分布變化，觀察辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期分布的影響。應(yīng)用Western Blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、CDK2、CDK4、p21、p27的表達(dá)，分析辛伐他汀誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞G

12、0/G1周期阻滯的可能分子機(jī)制。
　　5.應(yīng)用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測辛伐他汀對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用Western Blot檢測PI3K/Akt信號(hào)通路中PI3K、Akt、p-Akt的表達(dá)及下游的Bax、Bcl-2、cleaved PARP蛋白表達(dá)變化。分析辛伐他汀誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。
　　6.應(yīng)用PI3K/Akt信號(hào)通路激活劑IGF-1和特異性抑制劑LY294002及不同濃度的辛伐他汀分別或者共同作用MN

13、NG/HOS細(xì)胞后，提取總蛋白，檢測PI3K、Akt、p-Akt的表達(dá)及下游的Bax、Bcl-2、cleaved PARP蛋白表達(dá)變化，分析PI3K/Akt信號(hào)通路在辛伐他汀誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡中的作用。
　　7.建立骨肉瘤MNNG/HOS細(xì)胞的動(dòng)物模型，給予腹腔注射辛伐他汀或生理鹽水，定期稱量裸鼠體重，測量計(jì)算移植瘤的體積。觀察辛伐他汀對(duì)動(dòng)物模型中骨肉瘤的生長抑制情況。
　　結(jié)果：
　　1.辛伐他汀以時(shí)間和濃度依賴方式

14、抑制骨肉瘤細(xì)胞MNNG//HOS的增殖。
　　2.辛伐他汀抑制骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS的遷移，并呈劑量依賴性。
　　3.辛伐他汀抑制骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS的侵襲，并呈劑量依賴性。同時(shí)，MNNG/HOS細(xì)胞中的MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)明顯下降，說明辛伐他汀抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　4.辛伐他汀誘導(dǎo)MNNG/HOS細(xì)胞G0/G1周期阻滯。Western

15、Blot結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)cyclin D1、CDK2、CDK4蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而p21和p27蛋白的表達(dá)則被明顯上調(diào)，這個(gè)結(jié)果解釋了辛伐他汀誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞G0/G1周期阻滯的可能分子機(jī)制。
　　5.辛伐他汀作用后，MNNG/HOS細(xì)胞凋亡比率明顯增加并與劑量正相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，辛伐他汀作用后PI3K和p-Akt(Ser473)蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而總Akt的表達(dá)沒有顯著變化。同時(shí)，Bax的表達(dá)增加，而Bc

16、l-2的表達(dá)下降，導(dǎo)致Bax/Bcl-2的表達(dá)比率明顯上升，下游cleaved PARP的表達(dá)增加。
　　6.IGF-1能通過上調(diào)PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)而活化PI3K/Akt信號(hào)通路，而辛伐他汀與之作用相反，起到了類似于LY294002的通路抑制作用，其下游的Bax/Bcl-2的表達(dá)比率也發(fā)生了對(duì)應(yīng)的變化。IGF-1與辛伐他汀共同作用MNNG/HOS細(xì)胞后辛伐他汀對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，證明辛伐他汀誘導(dǎo)

17、凋亡的主要分子機(jī)制涉及PI3K/Akt信號(hào)通路的失活。
　　7.成功利用裸鼠建立骨肉瘤細(xì)胞的動(dòng)物模型。辛伐他汀對(duì)荷瘤裸鼠的體重及日?；顒?dòng)沒有明顯影響，具有較好的耐受性，辛伐他汀組的移植瘤體積要明顯小于對(duì)照組腫瘤體積，證實(shí)了辛伐他汀抗骨肉瘤作用的有效性。
　　結(jié)論：
　　1.辛伐他汀能夠有效的抑制體外骨肉瘤細(xì)胞系的增殖并明顯抑制動(dòng)物模型中骨肉瘤的生長。
　　2.辛伐他汀抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲，可能與下調(diào)MMP-2