miR-143在骨肉瘤細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤是最常見的起源于骨骼系統(tǒng)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，特點(diǎn)是高發(fā)生率，高度惡性，高轉(zhuǎn)移率，因此預(yù)后較差，腫瘤的發(fā)生給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了很大的花費(fèi)和負(fù)擔(dān)。近20年以來(lái)，盡管國(guó)際諸多研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行了大量的努力，但骨肉瘤患者生存率依然停滯不前，仿佛進(jìn)入了骨肉瘤治療的瓶頸期。同時(shí)化療耐藥的出現(xiàn)也讓化療方案的推廣舉步維艱，激進(jìn)的化療方案的副作用讓很多骨肉瘤患者難以堅(jiān)持完成治療。為此，對(duì)骨肉瘤的深入研究迫在眉睫。
　　近年來(lái)

2、有關(guān)微小RNA(microRNA，miRNA)的研究成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。在人類多種癌細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了miRNA的表達(dá)異常，miRNA既可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)而起到癌基因的作用，也可抑制腫瘤生長(zhǎng)而起到抑癌基因的作用。最近的研究提示miR-143參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化、遷移侵襲、凋亡等生理過(guò)程，但總體而言miR-143的作用主要起到類似抑癌基因的功能。然而，針對(duì)miR-143的研究大多集中于上皮組織來(lái)源的癌細(xì)胞，對(duì)于間葉源性的惡性腫瘤

3、細(xì)胞尤其是骨肉瘤中miR-143的作用報(bào)道較少。我們?cè)诒狙芯客ㄟ^(guò)檢測(cè)骨肉瘤組織和鄰近正常組織中miR-143的表達(dá)，并通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)靶基因后檢測(cè)靶基因的表達(dá)情況。通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-143及特異性抑制序列來(lái)敲除miR-143的作用，觀察體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞系中靶基因的表達(dá)情況，并檢測(cè)miR-143對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響，以期闡明miR-143在骨肉瘤中的作用，為靶向治療骨肉瘤提供可能的思路。
　　研究目的：
　　

4、1.觀察miR-143在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平。
　　2.觀察miR-143對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的影響。
　　3.尋找miR-143的靶基因，闡明miR-143對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用。
　　研究方法：
　　1.收集骨肉瘤病人的標(biāo)本，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤標(biāo)本及周圍正常組織中miR-143的表達(dá)水平，比較miR-143在骨肉瘤和正常組織中的表達(dá)差異。
　　2.通過(guò)生物信息學(xué)方法及軟件預(yù)測(cè)miR-143的靶基因?yàn)锽

5、cl-2，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤標(biāo)本及周圍正常組織中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western Blot方法檢測(cè)骨肉瘤標(biāo)本及周圍正常組織中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。
　　3.利用脂質(zhì)體2000將miR-143模擬物及陰性對(duì)照序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MG63骨肉瘤細(xì)胞系，建立過(guò)表達(dá)miR-143的骨肉瘤細(xì)胞系。
　　4.利用CCK-8檢測(cè)不同時(shí)間段過(guò)表達(dá)miR-143的骨肉瘤細(xì)胞系及陰性對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞活性，觀

6、察miR-143對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
　　5.利用Transwell方法檢測(cè)不同時(shí)間段過(guò)表達(dá)miR-143的骨肉瘤細(xì)胞系及陰性對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞穿膜數(shù)量，觀察miR-143對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響。
　　6.預(yù)測(cè)miR-143的靶基因，并構(gòu)建相應(yīng)靶基因的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，與miR-143模擬物及陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染MG63骨肉瘤細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，判斷miR-143的靶基因。
　　7.轉(zhuǎn)染miR

7、-143模擬物及抑制物后通過(guò)RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)靶基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的變化，分析miR-143對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用。
　　8.將miR-143模擬物及陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染MG63骨肉瘤細(xì)胞系后，應(yīng)用AnnexinⅤ/PI雙染色后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率的變化，來(lái)觀察miR-143對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.12例骨肉瘤標(biāo)本中的miR-143表達(dá)水平同鄰近正常

8、組織中相比明顯下降，只有鄰近正常組織的56％。
　　2.通過(guò)T argetScan軟件預(yù)測(cè)miR-143的靶基因可能是Bcl-2。免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)骨肉瘤標(biāo)本中的Bcl-2表達(dá)水平較正常組織相比明顯升高。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bcl-2的mRNA表達(dá)水平較正常組織明顯升高，Western Blot結(jié)果顯示骨肉瘤組織中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯增加，約為鄰近正常組織的1.9倍。
　　3.通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法成功建立miR-14

9、3高表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞系。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-14348h及72h時(shí)，骨肉瘤細(xì)胞活性明顯下降，分別為對(duì)照組的78.6％和65.4％。miR-143能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。
　　5.轉(zhuǎn)染miR-14372h時(shí)，骨肉瘤細(xì)胞的穿出Transwe11小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。miR-143能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力。
　　6.成功構(gòu)建候選靶基因Bcl-2的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染miR-143和Bcl-2報(bào)告基因后熒光素

10、酶失活，證實(shí)Bcl-2是miR-143的靶基因。
　　7.過(guò)表達(dá)miR-143的骨肉瘤細(xì)胞中，Bcl-2的mRNA明顯下調(diào)，蛋白表達(dá)水平明顯降低，而應(yīng)用miR-143抑制物可上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)。miR-143通過(guò)抑制Bcl-2表達(dá)發(fā)揮作用。
　　8.過(guò)表達(dá)miR-143明顯增加骨肉瘤細(xì)胞凋亡比率，其機(jī)制可能與miR-143介導(dǎo)的Bcl-2下調(diào)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.骨肉瘤組織中miR-143的表達(dá)降低，