miR-139-5p在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤是一種起源于間葉組織的骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在原發(fā)性骨腫瘤中均居首位。骨肉瘤多發(fā)于15-25周歲的青少年，其發(fā)展進(jìn)程快，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率高，患者生存旅較低，行單一手術(shù)切除術(shù)治療的患者5年生存率僅為15-20％，已成為青少年健康的一大威脅。隨著醫(yī)療技術(shù)的迅猛發(fā)展，新輔助放化療聯(lián)合保肢術(shù)替代截肢術(shù)成為骨肉瘤治療的主要外科手段，雖然患者預(yù)后水平有所提高，但放化療并不具有靶向性，并不能有效清除腫瘤細(xì)胞，患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，且保肢術(shù)

2、后還需輔助骨組織重建術(shù)，價(jià)格昂貴，給患者帶來一定的經(jīng)濟(jì)壓力。目前，骨肉瘤新型治療手段如免疫療法、介入治療、中醫(yī)藥治療及基因靶向治療成為攻克骨肉瘤的突破口。其中基因靶向治療可靶向在骨肉瘤發(fā)展進(jìn)程中起重要功能的癌相關(guān)基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)特性，而成為有效治愈骨肉瘤的新希望。因此，進(jìn)一步揭示骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制全貌，探索新的分子治療靶點(diǎn)，為基因靶向治療提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，具有重要的臨床意義和科學(xué)價(jià)值。

3、r>　　隨著第二代高通量測序技術(shù)的成熟和廣泛應(yīng)用，針對腫瘤組織和細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)如外顯子測序、轉(zhuǎn)錄組測序、miRNAs測序、lncRNA測序和單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)等為基因靶向治療的研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持，腫瘤學(xué)研究由此迎來了“數(shù)據(jù)爆炸”時(shí)代。在當(dāng)今大數(shù)據(jù)時(shí)代，一系列整合了大量腫瘤樣本的基因測序數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫如TCGA、Oncomine等也應(yīng)運(yùn)而生，被廣泛的應(yīng)用到腫瘤學(xué)的研究中來。TCGA數(shù)據(jù)庫是當(dāng)今最大的數(shù)據(jù)庫，其涵蓋全球范圍內(nèi)29種

4、類型的腫瘤超過1萬例樣本的外顯子測序數(shù)據(jù)、SNP數(shù)據(jù)、CMV數(shù)據(jù)及全面的臨床數(shù)據(jù)，成為腫瘤學(xué)研究的一把利劍。目前圍繞TCGA數(shù)據(jù)庫展開的相關(guān)研究發(fā)表在《Science》、《Nature》、《PNS》等一系列重量級科學(xué)刊物。但利用TCGA大數(shù)據(jù)進(jìn)行骨肉瘤的研究則未見報(bào)道。因此，在當(dāng)今大數(shù)據(jù)時(shí)代，如何運(yùn)用腫瘤大數(shù)據(jù)對骨肉瘤進(jìn)行深入的研究，進(jìn)一步完善骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，成為當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的一大趨勢。
　　microRNAs是一類長

5、度約為21-23nt的在物種間具有高度保守性的非編碼RNA，之前的研究認(rèn)為miRNA是一種不具備功能的基因轉(zhuǎn)錄的“垃圾產(chǎn)物”，隨著深入的研究，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，miRNA可以6-8個(gè)堿基不完全互補(bǔ)配對的方式與靶基因3'UTR區(qū)域結(jié)合，發(fā)揮對基因表達(dá)負(fù)向調(diào)控的作用。因此，miRNA在調(diào)控細(xì)胞的各項(xiàng)生理功能如增殖、分化、凋亡衰老方面具有重要的功能。并于2002年被《Science》雜志評為十大科技突破第一名。目前在哺乳動(dòng)物中已鑒定出的miRNA

6、多達(dá)上千條序列，并且仍不斷有新的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。近年來，隨著對miRNA在腫瘤學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤中有許多miRNA對癌相關(guān)基因具有重要的調(diào)控作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，被認(rèn)為是治療腫瘤的潛在的分子靶點(diǎn)。因此，進(jìn)一步探索和研究在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性調(diào)控作用的miRNAs，將對于進(jìn)一步明確骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中伴隨的分子機(jī)制，以及探索新的分子治療靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義。
　　第一部分:基于TCGA腫瘤數(shù)

7、據(jù)分析miR-139在骨肉瘤中的表達(dá)及其表觀調(diào)控機(jī)制研究
　　在本部分的研究中，利用TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫中的骨肉瘤miRNA芯片數(shù)據(jù)，篩選在骨肉瘤中發(fā)生顯著差異表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)發(fā)生顯著下調(diào)表達(dá)的miRNAs有70條，發(fā)生顯著上調(diào)表達(dá)的miRNAs有115條。在顯著上調(diào)的miRNAs中，miR-139-5p是下調(diào)最為顯著且未在骨肉瘤中有報(bào)道的miRNA。本文采用qRT-PCR檢測了骨肉瘤組織及細(xì)胞系中miR-139-5p的表達(dá)

8、，結(jié)果進(jìn)一步說明miR-139-5p在骨肉瘤中發(fā)生了下調(diào)表達(dá)。為了探究miR-139-5p在骨肉瘤中發(fā)生下調(diào)表達(dá)的分子機(jī)制，本文采用CHIP實(shí)驗(yàn)檢測了miR-139啟動(dòng)子區(qū)組蛋白的甲基化及乙?；揎椙闆r發(fā)現(xiàn)，miR-139在骨肉瘤中的下調(diào)表達(dá)是由miR139啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K27、H3K9甲基化水平上調(diào)，H3K4甲基化水平下調(diào)以及H3乙酰化水平下調(diào)所介導(dǎo)的。此外，本文結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤樣本的臨床數(shù)據(jù)，分析了miR-139-5p

9、表達(dá)與患者生存期的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p高表達(dá)患者的生存期顯著高于低表達(dá)患者。通過以上結(jié)果，我們初步推斷miR-139-5p在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。
　　第二部分：miR-139-5p對骨肉瘤惡行生物學(xué)表型的調(diào)控作用及其分子機(jī)制研究
　　為了研究miR-139-5p在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本文首先采用qRT-PCR檢測了miR-139-5p mimics的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-139-5p mi

10、mics可顯著提高骨肉瘤細(xì)胞MG63及U20S中miR-139-5p水平。接下來，我們采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測了miR-139-5p對骨肉瘤增殖的影響發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p可顯著抑制骨肉瘤的增殖。采用Transwell檢測miR-139-5p對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，構(gòu)建裸鼠皮下抑制瘤模型，體內(nèi)過表達(dá)miR-139-5p后發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p可顯著抑制瘤體生長。因

11、此，得出結(jié)論:miR-139-5p可顯著抑制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　為了探究miR-139-5p發(fā)揮抑瘤作用的分子機(jī)制，首先采用Targetscan預(yù)測了miR-139-5p的靶基因發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p可靶向Cdc42 mRNA3'UTR序列。為了進(jìn)一步探究miR-139-5p對Cdc42 mRNA3'UTR序列的靶向作用，我們構(gòu)建了Cdc42mRNA3'UTR區(qū)45-52位點(diǎn)的Luciferase雙熒光報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染miR

12、-139-5p后發(fā)現(xiàn)miR-139-5p可顯著抑制熒光生成。以上結(jié)果說明miR-139-5p可靶向Cdc42 mRNA3'UTR45-52位點(diǎn)。為了進(jìn)一步探究miR-139-5p對Cdc42是否有負(fù)向調(diào)控作用及其作用機(jī)制，我們檢測了轉(zhuǎn)染miR-139-5p后，骨肉瘤細(xì)胞Cdc42 mRNA及蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p并不抑制Cdc42 mRNA水平，可顯著抑制Cdc42蛋白的表達(dá)。通過以上結(jié)果，我們得出結(jié)論:miR-139-5

13、p可通過抑制Cdc42 mRNA的翻譯從而對Cdc42基因表達(dá)起負(fù)向調(diào)控作用。
　　第三部分：Cdc42對骨肉瘤惡行生物學(xué)表型的調(diào)控作用研究
　　在本部分中，探究了Cdc42基因在骨肉瘤中的表達(dá)及其對骨肉瘤惡性生物學(xué)表型的調(diào)控作用。首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤RNA-Seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，Cdc42mRNA并未在骨肉瘤中發(fā)生差異表達(dá)，采用qRT-PCR及Westernblot分別檢測了骨肉瘤組織和細(xì)胞系中Cdc42 mRNA和

14、蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Cdc42 mRNA并未在骨肉瘤中發(fā)生差異表達(dá)，但Cdc42蛋白在骨肉瘤中發(fā)生了顯著的上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果說明，Cdc42在骨肉瘤中發(fā)生顯著的上調(diào)表達(dá)，其上調(diào)表達(dá)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，miR-139-5p作為Cdc42轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控因子，在調(diào)控Cdc42表達(dá)上具有重要的作用。
　　接下來探究了Cdc42對骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響。CCK8結(jié)果顯示，沉默Cdc42表達(dá)可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cdc