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文檔簡介
1、骨肉瘤(osteosarcoma)是青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤,也是骨科學(xué)界治療的難點(diǎn)之一。據(jù)我國統(tǒng)計(jì)資料顯示,骨肉瘤發(fā)病率在原發(fā)性惡性骨腫瘤中占居首位。該瘤惡性程度甚高,預(yù)后極差,可于數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移,截肢后3~5年存活率僅為60%左右。
雖然近年來骨肉瘤在病因、發(fā)生發(fā)展、診斷和治療等方面有了一些進(jìn)展,但進(jìn)展十分緩慢,具體發(fā)病機(jī)制仍然不清楚。其次缺少骨肉瘤診斷和治療的有效靶標(biāo),進(jìn)一步尋找生物靶標(biāo),將具有重要的理論和臨床應(yīng)
2、用價值。同時如能獲得骨肉瘤血清診斷標(biāo)志物,將對骨肉瘤的診斷和治療帶來深遠(yuǎn)的影響。
microRNA是一種不編碼蛋白質(zhì)的,約21-25nt大小的單鏈小分子RNA。通過特異性的結(jié)合靶基因來調(diào)控其表達(dá)。從1993年,第一個microRNA:lin-4被發(fā)現(xiàn)后,在過去的幾十年,大量的microRNA被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為在細(xì)胞的發(fā)生、分化、增殖和凋亡起著重要的作用。近期研究表明,microRNA的表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、預(yù)后相關(guān)。在不
3、同的腫瘤類型中,microRNA呈現(xiàn)兩種不一樣的角色:抑癌基因和癌基因。主要的作用機(jī)制包括:microRNA位點(diǎn)的缺失、擴(kuò)增、突變,表觀遺傳水平改變,轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的異常表達(dá)等。值得關(guān)注的是,microRNA具有一個重要特性,即在血漿和血清中非常穩(wěn)定,不會被RNA酶降解。這使得其實(shí)際值與病人身上所得的測試值吻合的很好,如果能在外周血標(biāo)本中找到特異性表達(dá)模式的microRNA生物標(biāo)記物,對于早期診斷和治療腫瘤具有重大的意義。
ST
4、AT3蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在生理狀態(tài)下,STAT3激活快速而短暫,對于正常細(xì)胞的生理功能起著關(guān)鍵性作用。STAT3是EGFR、IL26/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯聚的焦點(diǎn),在多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有持續(xù)性過度激活。STAT3過度激活后誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因異常高表達(dá),通過各種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、阻礙細(xì)胞凋亡。STAT3激活可上調(diào)多種抗調(diào)亡基因(c-myc)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因(cycli
5、n D1/D2)等,通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP、VEGF等表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成。而且STAT3與腫瘤的臨床生物學(xué)行為如腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的耐藥性等相關(guān)。
本課題利用microRNA表達(dá)芯片技術(shù)比較了六例骨肉瘤組織標(biāo)本與癌旁組織分化成熟區(qū)域,發(fā)現(xiàn)miR-125b在骨肉瘤病人腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。我們推測miR-125b在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,即潛在抑癌基因的功能。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明
6、miR-125b能明顯抑制骨肉瘤的增殖,遷移,但作用機(jī)制不明。通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)STAT3的3'UTR有一保守的miR-125b結(jié)合位點(diǎn),提示STAT3可能為miR-125b的候選下游靶基因。同時我們發(fā)現(xiàn)miR-125b的核心啟動區(qū)具有CAAT元件,兩個STAT3結(jié)合位點(diǎn),一個STAT6結(jié)合位點(diǎn),提示STAT3可以特異性結(jié)合于miR-125b核心啟動子區(qū)域。綜上所述,STAT3可以轉(zhuǎn)錄激活miR-125b,同時STAT3自身受
7、到miR-125b轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控,我們推論STAT3-miR-125b之間可能存在反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。生理狀態(tài)下,細(xì)胞不需要過多的STAT3,STAT3受miR-125b轉(zhuǎn)錄后抑制;過多的STAT3可通過轉(zhuǎn)錄激活產(chǎn)生更多的miR-125b,抑制STAT3而達(dá)到、維持miR-125b-STAT3間穩(wěn)態(tài)平衡。骨肉瘤細(xì)胞中,STAT3表達(dá)高而miR-125b表達(dá)下降,為什么持續(xù)激活的STAT3不能反饋轉(zhuǎn)錄激活miR-125b?進(jìn)一步分析表明miR-
8、125b啟動子具有CpG島,該反饋調(diào)節(jié)環(huán)路可能由于腫瘤細(xì)胞中啟動子表觀遺傳調(diào)節(jié)而打斷。本課題通過兩部分來研究STAT3-miR-125b反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制以及骨肉瘤患者中血清microRNAs生物標(biāo)記物的篩選。
第一部分:miR-125b-STAT3調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制研究:
(1) miR-125b-STAT3環(huán)路在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá);
(2) miR-
9、125b靶向調(diào)控下游基因:STAT3;
(3)STAT3對miR-125b的轉(zhuǎn)錄激活作用;
(4)骨肉瘤細(xì)胞miR-125b啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)。
第二部分:血清microRNA作為骨肉瘤生物標(biāo)記物的研究。通過這些研究,揭示miR-125b-STAT3反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶標(biāo)和可供診斷參考的生物標(biāo)志物,有望為骨肉瘤的臨床診斷和治療提供新的策略和方法。
第一部分
10、 miR-125b-STAT3調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制研究
第一節(jié) miR-125b-STAT3環(huán)路在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)
目的:研究骨肉瘤組織和細(xì)胞系中miR-125b和STAT3的表達(dá)水平。
方法:通過實(shí)時定量RT-PCR法,在骨肉瘤和癌旁組織二組樣品中以及骨肉瘤的三種細(xì)胞系,檢測miR-125b的表達(dá)水平。其次,通過免疫印跡法(Western blot)檢測骨肉瘤組織和細(xì)胞系中ST
11、AT3的蛋白水平。
結(jié)果:與癌旁組織相比,骨肉瘤組織中miR-125b水平顯著降低。與HEK-293細(xì)胞系相比,骨肉瘤的三種細(xì)胞系(MG-63,Saos-2,U2-OS)中miR-125b水平顯著降低。與癌旁組織相比,骨肉瘤中STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高;與HEK-293細(xì)胞系相比,骨肉瘤的三種細(xì)胞系(MG-63,Saos-2,U2-OS)中STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著提高。
結(jié)論:骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞中,miR
12、-125b表達(dá)水平顯著降低,而STAT3的表達(dá)水平顯著升高。此結(jié)果提示二者可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。
第二節(jié) miR-125b靶向調(diào)控下游基因STAT3
目的:驗(yàn)證STAT3為miR-125b的下游靶基因。
方法:
1.我們運(yùn)用Targetscans/PICTAR等靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-125b的下游靶基因可能為STAT3。
2.構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體將STAT3的3'UTR區(qū)包
13、含可能與miR-125b結(jié)合的一段序列克隆至pMIR-REPORTER Luciferase vector載體內(nèi),從而構(gòu)建STAT3野生型(STAT3 WT-luc)熒光素酶報告基因質(zhì)粒。而后通過點(diǎn)突變的方法使STAT3的3'UTR區(qū)包含可能與miR-125b結(jié)合的一段堿基序列發(fā)生突變,構(gòu)建STAT3突變型(STAT3MUT-luc)熒光素酶報告基因質(zhì)粒。采取脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將STAT3WT-luc和STAT3MUT-luc與miR-1
14、25b模擬物(miR-125b mimics)和陰性對照(Negative control)同時轉(zhuǎn)染到MG-63細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染48小時后收取細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)采取雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),以海腎熒光素酶(Renilla)作為內(nèi)參,檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。最終以二者的比值作為相對表達(dá)量數(shù)值(Firefly/Renilla)。
3.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將不同濃度miR-125b模擬物(miR-125b mimics)轉(zhuǎn)染
15、到Saos-2細(xì)胞內(nèi),采用蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)檢測STAT3蛋白表達(dá)水平;CKK8法檢測細(xì)胞增殖活性。
4.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將miR-125b模擬物(miR-125bmimics)、化學(xué)合成并化學(xué)修飾的miR-125b反義核酸(anti—miR-125b)或者陰性對照(Negative control)轉(zhuǎn)染至MG-63和Saos-2細(xì)胞內(nèi)。收集細(xì)胞后提取總蛋白,采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢
16、測STAT3蛋白表達(dá)水平。
結(jié)果:
1.STAT3為miR-125b的靶基因,miR-125b通過結(jié)合3'UTR區(qū)抑制靶基因STAT3的表達(dá)。
2.miR-125b濃度依賴性的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,過表達(dá)miR-125b能抑制Saos-2細(xì)胞增殖,抑制STAT3蛋白表達(dá)量。
3.轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物的骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表達(dá)量降低。
4.轉(zhuǎn)染miR-125b反
17、義核酸的骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表達(dá)量升高。
結(jié)論:STAT3是miR-125b的靶基因,miR-125b通過結(jié)合STAT3的3'UTR區(qū)抑制靶基因STAT3的表達(dá)。
第三節(jié) STAT3對miR-125b的轉(zhuǎn)錄激活作用
目的:探討STAT3作為重要的轉(zhuǎn)錄因子能否轉(zhuǎn)錄激活miR-125b。
方法:
1.我們首先采取CONSITE和PromoterInspector
18、軟件分析預(yù)測成熟miR-125b在人基因組上的兩個基因位點(diǎn)上游的10kb序列,分別是11號染色體上的miR-125b-1,21號染色體上的miR-125b-2。找到潛在的啟動子區(qū)域。
2.構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體將miR-125b-1前體5'端不同長度片段(-1600 to-900bp,-1400 to-900bp,-1175 to-900bp)序列克隆至PGL3載體。再轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中,轉(zhuǎn)染48小時后收
19、取細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)采取雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),以海腎熒光素酶(Renilla)作為內(nèi)參,檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。最終以二者的比值作為相對表達(dá)量數(shù)值(Firefly/Renilla)。
3.我們選用MatInspector軟件對啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析,找出可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
4.采取點(diǎn)突變的辦法使-1175 to-900bp序列中潛在的STAT3結(jié)合序列、STAT6結(jié)合序列和CAAT
20、序列發(fā)生堿基突變,構(gòu)成PGL3-mSTAT3,PGL3-mSTAT6和PGL3-mCAAT突變熒光素酶報告基因質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中,轉(zhuǎn)染48小時后收取細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)采取雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),以海腎熒光素酶(Renilla)作為內(nèi)參,檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。最終以二者的比值作為相對表達(dá)量數(shù)值(Firefly/Renilla)。
5.我們通過凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)來進(jìn)一
21、步鑒定STAT3蛋白和miR-125b前體上與STAT3蛋白相結(jié)合序列之間的相互作用,首先人工合成STAT3-wt、STAT3-consensus、 STAT3-mut、STAT6-wt寡核苷酸序列探針,其中STAT3-consensus為STAT3所識別的共有序列作為實(shí)驗(yàn)中的陽性對照,再將其中的STAT3-wt和STAT3-consensus用32P同位素標(biāo)記上,根據(jù)不同的探針組合、STAT3抗體與MG-63細(xì)胞核蛋白提取物共孵育,最
22、后根據(jù)DNA-蛋白復(fù)合物的位置、特點(diǎn)和強(qiáng)度來判斷特異性結(jié)合。
結(jié)果:
1.通過CONSITE和PromoterInspector軟件我們發(fā)現(xiàn)miR-125b-1有一個RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子位于miR-125b前體序列上游-1600to-900bp。
2.分析不同片段的熒光素酶活性,我們確定核心啟動子序列位于-1175 to-900bp區(qū)域。
3.通過MatInspector軟件分析,我們預(yù)測在其
23、核心啟動子區(qū)域具有CAAT元件,兩個STAT3結(jié)合位點(diǎn),一個STAT6結(jié)合位點(diǎn)。
4.突變體熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)CAAT元件和STAT3位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變后,熒光素酶活性顯著下降。而STAT6位點(diǎn)突變后,熒光素酶活性無明顯變化。
5.EMSA蛋白-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),[32p]-STAT3-wt探針和MG-63細(xì)胞核蛋白提取物孵育后能被檢測到DNA-蛋白復(fù)合物的形成。作為陽性對照的[32p]-STAT3-consen
24、sus同樣被檢測到形成DNA-蛋白復(fù)合物并且遷移到同一個位置。其次,[32p]-STAT3-wt探針一蛋白復(fù)合物的形成能明顯被STAT3-consensus、未標(biāo)記探針和STAT3抗體競爭抑制,而不會被堿基序列突變的探針競爭抑制。
結(jié)論:STAT3蛋白能結(jié)合到miR-125b前體序列的核心啟動區(qū)轉(zhuǎn)錄激活miR-125b。
第四節(jié)骨肉瘤細(xì)胞miR-125b啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)
目的:探討骨肉瘤細(xì)胞中miR-1
25、25b啟動子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。
方法:選用骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和Saos-2,使用去甲基化藥物5-Aza-2'-deoxycytidine處理細(xì)胞后,觀察其對細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)miR-125b表達(dá)水平的影響。同時通過試劑盒提取MG-63和Saos-2中的DNA,再經(jīng)過亞硫酸氫鈉的處理,最后通過甲基化特異性PCR檢測miR-125b啟動子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。
結(jié)果:
1.隨著去甲基化藥物5-Aza-
26、2'-deoxycytidine濃度的提高,細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制作用。
2.隨著去甲基化藥物5-Aza-2'-deoxycytidine濃度的提高,miR-125b表達(dá)水平明顯升高。
3.甲基化特異性PCR檢測骨肉瘤細(xì)胞miR-125b啟動子區(qū)域的甲基化水平升高。
結(jié)論:骨肉瘤細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平的降低可能與miR-125b啟動子區(qū)域DNA的高甲基化相關(guān)。
第二部分血清microRN
27、A作為骨肉瘤生物標(biāo)記物的研究
目的:篩選出骨肉瘤病人血清標(biāo)本中差異表達(dá)的microRNA,研究其作為診斷骨肉瘤血清標(biāo)記物的潛能。
方法:采用microRNA PCR芯片篩選骨肉瘤患者和正常對照組血清microRNA表達(dá)譜,選擇差異表達(dá)的血清microRNA。將篩選出來的候選microRNA進(jìn)一步用qRT-PCR在20例腫瘤標(biāo)本和20例正常對照組驗(yàn)證,ROC分析用來評價其診斷性能。
結(jié)果:首先通過芯片篩選出來
28、14個候選microRNA,在此基礎(chǔ)上,擴(kuò)大標(biāo)本量驗(yàn)證,得7個差異表達(dá)的血清microRNA(miR-106a-5p,miR16-5p, miR-20a-5p, miR-425-5p, miR451a, miR-25-3P,miR139-5p), AUC分別是0.7255(95% CI0.5435-0.9075),0.7686(95%CI0.6067-0.9306),0.8471(95% CI0.7155-0.9786),0.7961(
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