MicroRNA-27a調(diào)控骨肉瘤生物學行為的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分骨肉瘤細胞系miRNA表達譜的分析研究
  目的:探索miRNA在不同骨肉瘤細胞系中的表達特征及差異,明確骨肉瘤細胞miRNA的共同表達譜,并為后續(xù)的機制研究提供方向指導。
  方法:收集四種人骨肉瘤細胞系(U-2OS,Saos-2,MNNG/HOS,MG63)和人成骨細胞系(hFOB),提取細胞中的總RNA,應用miRNA表達譜芯片進行掃描篩查分析,建立骨肉瘤細胞系的miRNA表達譜。
  結果:應用 miR

2、NA表達譜芯片檢測四種人骨肉瘤細胞系(U-2OS,Saos-2,MNNG/HOS,MG63)和人成骨細胞系(hFOB)之間具有差異性表達特點的miRNA。我們發(fā)現(xiàn):相對于人成骨細胞系,在四種人骨肉瘤細胞系中表達差異達2倍及以上的miRNA共有27個,其中表達水平上調(diào)的miRNA共有23個(let-7e-5p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-125a-5p,miR-196a-5p,miR-214-3p,miR-20a-

3、5p,miR-181a-5p,miR-29b-3p,miR-10b-5p,miR-301a-3p,miR-181d,miR-21-5p,miR-206,miR-7-5p,miR-29a-3p,miR-17-5p,miR-210,miR-25-3p,miR-18a-5p,miR-181c-5p,miR-32-5p,miR-27a-3p),表達水平下調(diào)的miRNA共有4個(miR-142-5p,miR-133b,miR-16,miR-144

4、-3p)。
  結論:通過 miRNA表達譜芯片的檢測與篩選,我們發(fā)現(xiàn)與人成骨細胞系相對比,在四種人骨肉瘤細胞系(U-2OS,Saos-2,MNNG/HOS,MG63)共有27個miRNA呈差異性表達的特點。這些具有差異性表達的miRNA可以為進一步研究miRNA在骨肉瘤中的作用與功能提供一定的實驗基礎及方向指導。
  第二部分miR-27a調(diào)控骨肉瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲的機制研究
  目的:觀察miR-27a對骨肉

5、瘤細胞增殖、凋亡和侵襲影響及其調(diào)控機制。
  方法:利用Lipofectamine?2000將miR-27a inhibitor、miR-27a negative control、miR-27a mimics和miR-27a mimics control轉染于骨肉瘤細胞系。利用Caspase-3、8和9酶活性試劑盒檢測檢測Caspase-3、8和9酶活性,流式細胞檢測各組細胞的凋亡情況,MTT實驗檢測對細胞增殖的影響,Transw

6、ell遷移與侵襲實驗評價細胞遷移侵襲能力,細胞克隆形成實驗評價骨肉瘤細胞克隆形成的能力,qRT-PCR和Western blot檢測骨肉瘤細胞PUMA、BAK和BAX表達情況。建立裸鼠皮下骨肉瘤瘤模型,繪制腫瘤生長曲線,測量腫瘤體積以及腫瘤重量,qRT-PCR和Western blotting檢測PUMA、BAK和BAX表達情況。結果:與其他組相比,miR-27a inhibitor組骨肉瘤細胞的Caspase-3、9酶活性顯著增加(P

7、<0.01),Caspase-8酶活性也有增加(與無轉染組對比P<0.05),細胞的凋亡率顯著增加(P<0.01),增殖明顯受到抑制(P<0.01),遷移顯著減少(P<0.01),細胞的穿膜細胞數(shù)顯著減少(P<0.01),細胞的克隆形成數(shù)目顯著減少(P<0.01)。miR-27a的表達水平與PUMA蛋白表達呈顯著的負相關性,熒光素酶報告法證實PUMA基因的3’UTR可以被miR-27a結合。動物實驗結果發(fā)現(xiàn),miR-27a inhibi

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