印跡基因TSSC3對(duì)骨肉瘤生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的一種高轉(zhuǎn)移性骨原發(fā)惡性腫瘤，肺轉(zhuǎn)移是最主要的死亡原因。骨肉瘤的轉(zhuǎn)移多發(fā)生于早期，85%～90%的患者就診時(shí)已存在臨床上不能發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶。近年來(lái)的新輔助化療使得患者肺轉(zhuǎn)移率得到明顯控制，骨肉瘤患者的預(yù)后得到了很大的提高，5年生存率達(dá)到60%～80%。但骨肉瘤的長(zhǎng)期生存率并沒(méi)有明顯提高，骨肉瘤的治療效果仍處于“瓶頸期”，骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性差以及對(duì)化療藥物的耐藥是影響其化療療效的主要因素。因此，控制骨肉瘤的轉(zhuǎn)

2、移和克服化療耐藥對(duì)于提高骨肉瘤患者的生存率有重要意義。
　　 腫瘤的轉(zhuǎn)移包含了一系列的復(fù)雜事件。腫瘤細(xì)胞獲得“失巢凋亡抵抗”是其成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，而細(xì)胞周期阻滯和凋亡通路障礙也是化療耐藥產(chǎn)生的主要機(jī)制之一，因此探討骨肉瘤耐藥及失巢凋亡抵抗的機(jī)制將為深入闡明骨肉瘤轉(zhuǎn)移及耐藥提供有意義的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，印跡基因TSSC3參與了成骨細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。TSSC3是已報(bào)道的唯一與凋亡相關(guān)的印跡基

3、因。目前關(guān)于TSSC3與腫瘤的研究很少，僅在完全性葡萄胎、Wilms’腫瘤和惡性膠質(zhì)瘤中有表達(dá)缺失的報(bào)道，其在骨肉瘤中的表達(dá)情況及其發(fā)揮的功能作用和分子機(jī)制尚缺乏相關(guān)研究。
　　 有鑒于此，本研究共分三部分。第一部分檢測(cè)了TSSC3在各骨肉瘤細(xì)胞系以及骨肉瘤組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究TSSC3在骨肉瘤中所發(fā)揮的功能作用。第二部分探討了TSSC3對(duì)各凋亡通路關(guān)鍵分子表達(dá)變化的影響；并進(jìn)一步探討了TSSC3對(duì)

4、骨肉瘤化療敏感性的影響及其分子機(jī)制。第三部分在第一、二部分對(duì)TSSC3在骨肉瘤中表達(dá)、功能及作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討TSSC3調(diào)控骨肉瘤失巢凋亡抵抗進(jìn)而在骨肉瘤遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容和主要結(jié)果結(jié)論如下：
　　 一、TSSC3在骨肉瘤細(xì)胞系和骨肉瘤組織中普遍低表達(dá)，提示其表達(dá)可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)
　　 1.TSSC3在骨肉瘤細(xì)胞系中普遍低表達(dá)：
　　 采

5、用熒光定量PCR、RT-PCR和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)方法得到如下結(jié)果：
　　 (1)TSSC3在惡性轉(zhuǎn)化的成骨細(xì)胞(MTF)中的表達(dá)明顯低于hFOB1.19成骨細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)TSSC3在成骨細(xì)胞系中的表達(dá)均高于所有被檢測(cè)的骨肉瘤細(xì)胞系，其在低級(jí)別來(lái)源的骨肉瘤細(xì)胞系HOS和MG63中的表達(dá)要高于高級(jí)別來(lái)源的細(xì)胞系U2OS和SaOS2，且TSSC3主要定位于胞質(zhì)。
　　 2.TSSC3在骨肉瘤組織

6、中普遍低表達(dá)：
　　 我們采用RT-PCR和卡方檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到如下結(jié)果：
　　 (1)TSSC3在腫瘤組織(陽(yáng)性率為45.8%，表達(dá)豐度為0.18±0.03)中的表達(dá)顯著低于配對(duì)癌旁組織(陽(yáng)性率為79.1%，表達(dá)豐度為0.52±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)TSSC3在骨肉瘤組織(54.2%)中的表達(dá)缺失率顯著高于配對(duì)癌旁組織(20.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但骨肉瘤組織中TSSC3的表達(dá)缺失

7、率與骨肉瘤患者的性別、年齡和病理組織學(xué)分型沒(méi)有顯著的相關(guān)性。
　　 二、TSSC3的表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖
　　 1.采用GeneSwitch誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)TSSC3的SaOS2細(xì)胞系(overTSSC3)；采用pSilencer5.1 Retro表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)TSSC3的SaOS2細(xì)胞系(siTSSC3)。
　　 2.TSSC3的表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖：
　　 (

8、1)CCK8比色法顯示：overTSSC3細(xì)胞在接種2天后，增殖速率顯著低于對(duì)照組(SaOS2和overCON)；相反，siTSSC3細(xì)胞在接種5天后，增殖速率顯著高于對(duì)照組(SaOS2和siCON)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：過(guò)表達(dá)TSSC3明顯地降低了大克隆形成率(從17.75±0.01%降低到0.67±0.01%)；相反，siTSSC3細(xì)胞的總克隆、大克隆、小克隆形成數(shù)均顯著高于對(duì)照組(SaOS

9、2和siCON)，特別是大克隆形成數(shù)從7±2升高到107±12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)Ki67免疫熒光染色顯示：高表達(dá)TSSC3明顯地降低了Ki67的表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性率；反之，低表達(dá)TSSC3則顯著地增強(qiáng)了Ki67的表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)PI染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA倍體分析顯示：高表達(dá)TSSC3使G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加；反之，低表達(dá)TSSC3則使G0/G1期細(xì)胞比例顯著降

10、低。
　　 3.TSSC3的表達(dá)抑制了裸鼠體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞的增殖：
　　 (1)免疫缺陷小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示：overTSSC3組成瘤率為18%，成瘤潛伏期為28天，接種7周后移植瘤體積為15.94±9.28(mm3±SD)；對(duì)照組SaOS2、overCON的成瘤率分別為86%和67%，成瘤潛伏期分別為14天和16天，接種7周后移植瘤體積分別為90.17±15.42(mm3±SD)和159.75±73.65(mm3±SD)，

11、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，siTSSC3組成瘤率為100%，成瘤潛伏期為6天，接種5周后移植瘤體積為153.45±42.38(mm3±SD)；siCON組成瘤率為67%，成瘤潛伏期為12天，接種5周后移植瘤體積為66.10±24.64(mm3±SD)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明TSSC3明顯地降低了骨肉瘤細(xì)胞體內(nèi)的成瘤力。
　　 (2)HE染色觀察移植瘤組織形態(tài)，結(jié)果顯示：siTSSC3和SaOS2組來(lái)源的移植瘤，細(xì)胞大小不一，細(xì)

12、胞核深染且異形性大，可見(jiàn)部分病理性核分裂像，有較多的壞死灶和高密度的微血管；而在overTSSC3組來(lái)源的移植瘤組織中，沒(méi)有觀察到壞死組織、病理性核分裂像以及高密度的微血管。結(jié)果說(shuō)明低表達(dá)TSSC3使移植瘤更加接近于骨肉瘤的組織學(xué)特征。
　　 (3)免疫組化染色檢測(cè)移植瘤組織中TSSC3、Ki67表達(dá)，結(jié)果顯示：overTSSC3組高表達(dá)TSSC3，SaOS2組弱表達(dá)TSSC3，siTSSC3組中未檢測(cè)到TSSC3的表達(dá)。采用K

13、i67染色，對(duì)瘤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，overTSSC3組低表達(dá)Ki67，siTSSC3組高表達(dá)Ki67，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明TSSC3在移植瘤組織中的表達(dá)與Ki67的表達(dá)負(fù)相關(guān)。
　　 三、TSSC3的表達(dá)通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的凋亡
　　 1.TSSC3的表達(dá)促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的凋亡：
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組SaOS2、overCON細(xì)胞呈短梭形，折光性強(qiáng)，透明度大，輪

14、廓不清，胞質(zhì)中未見(jiàn)顆粒樣物質(zhì)；而overTSSC3細(xì)胞則生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)不規(guī)則，失去原有特點(diǎn)，折光性降低，細(xì)胞間隙增大，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞活力差，并有較多懸浮細(xì)胞。透射電鏡下觀察，overTSSC3細(xì)胞較對(duì)照組顯示出了凋亡的特征，核膜不規(guī)則，核濃縮碎裂，出現(xiàn)新月體形核，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡及凋亡小體。以上形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果提示了TSSC3對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。
　　 (2)AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果

15、顯示：相對(duì)于對(duì)照組，overTSSC3組的早期凋亡和晚期凋亡率分別從5.70%和1.39%明顯地提高到了14.70%和9.97%。相反，低表達(dá)TSSC3使早期和晚期凋亡率分別下調(diào)了4.04倍和4.32倍。另外，我們采用PI染色檢測(cè)亞G0期細(xì)胞的比率，細(xì)胞的凋亡率隨著TSSC3的表達(dá)下調(diào)而下降。TUNEL染色的結(jié)果同樣顯示了在overTSSC3細(xì)胞中，F(xiàn)ITC陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)要明顯地高于對(duì)照組。
　　 2.TSSC3的表達(dá)促進(jìn)了瘤體

16、細(xì)胞的凋亡：移植瘤組織TSSC3和TUNEL免疫熒光雙染結(jié)果顯示：相對(duì)于對(duì)照組，overTSSC3細(xì)胞來(lái)源的移植瘤組織中TSSC3和TUNEL染色的比例和強(qiáng)度同時(shí)明顯地增加，且共定位于同一細(xì)胞中，結(jié)果表明持續(xù)的TSSC3表達(dá)明顯增加了瘤體細(xì)胞的凋亡。
　　 3.TSSC3通過(guò)線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡：
　　 (1)熒光定量PCR結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3明顯地增加了caspase-3和Cytc的表達(dá)，并

17、同時(shí)上調(diào)了Bax：Bcl-2的比率；對(duì)于死亡受體通路而言，TSSC3的上調(diào)反而引起了Fas的下調(diào)以及Flip的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。反之，相對(duì)于siCON細(xì)胞，在siTSSC3細(xì)胞中caspase-3，Cytc，Bax：Bcl-2和Flip分子明顯地下調(diào)，F(xiàn)as則明顯地上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3在基因水平通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性線粒體通路發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 (2)免疫熒光染色結(jié)果顯示：相對(duì)于overCON細(xì)胞，

18、overTSSC3細(xì)胞上調(diào)了cleavedcaspase-3的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)procaspase-9和Bcl-2的表達(dá)。相反，相對(duì)于siCON細(xì)胞，procaspase-9和Bcl-2在siTSSC3細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，但是procaspase-8的表達(dá)在overTSSC3細(xì)胞和overCON細(xì)胞中沒(méi)有明顯的不同。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3明顯增加了cleaved caspase-3和Cytc蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)

19、顯著下調(diào)了Fas蛋白的表達(dá)；而Cytc在siTSSC3細(xì)胞中的表達(dá)則明顯低于siCON細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3在蛋白水平通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性線粒體通路發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 (3)JC-1染色結(jié)果顯示：overCON細(xì)胞展示出桔紅色的熒光，代表正常細(xì)胞線粒體的JC-1聚合體，而在overTSSC3細(xì)胞中紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光，更加接近于陽(yáng)性對(duì)照，代表凋亡細(xì)胞線粒體的JC-1單體。TSSC3使綠色/紅色熒光強(qiáng)度的

20、比值從0.90±0.04增加到4.31±0.87，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3破壞了線粒體膜電位，誘導(dǎo)了內(nèi)源性凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　 四、TSSC3通過(guò)誘導(dǎo)線粒體途徑的凋亡增加了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性
　　 1.TSSC3通過(guò)誘導(dǎo)凋亡增加了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性：
　　 (1)AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：順鉑和表柔比星處理后，overTSSC3細(xì)胞的凋亡率(特別

21、是晚期凋亡率)明顯地高于overCON細(xì)胞。而低表達(dá)TSSC3則明顯地降低了化療藥處理后細(xì)胞的凋亡。
　　 (2)TUNEL免疫熒光染色結(jié)果顯示：overTSSC3細(xì)胞在化療藥處理后FITC熒光強(qiáng)度明顯地高于對(duì)照細(xì)胞。
　　 2.TSSC3通過(guò)線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑明顯地增加了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥處理的敏感性：
　　 (1)免疫熒光染色結(jié)果顯示：化療藥處理后，cleaved caspase-3在overTSSC3細(xì)

22、胞表達(dá)強(qiáng)度顯著高于overCON細(xì)胞。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示：Cytc、cleaved caspase-3以及cleaved PARP在overTSSC3細(xì)胞的表達(dá)水平顯著地高于對(duì)照細(xì)胞；相反，Cytc在siTSSC3細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于siCON細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)JC-1免疫熒光染色結(jié)果顯示：化療藥處理后，JC-1單體在overTSSC3細(xì)胞中的表達(dá)明顯地高于overCON細(xì)胞，高表達(dá)TSSC

23、3使綠色/紅色熒光強(qiáng)度的比值從1.33±0.67增加到6.73±1.65，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。線粒體膜電位的破壞以及Cytc等凋亡分子在overTSSC3細(xì)胞中表達(dá)的增加，說(shuō)明TSSC3通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)了化療藥引起的骨肉瘤細(xì)胞凋亡。
　　 五、TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過(guò)程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)
　　 1.成功建立了骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗模型：
　　 (1)懸浮-貼壁循環(huán)培養(yǎng)法建立骨肉瘤失巢凋亡抵抗細(xì)胞模型：

24、SaOS2懸浮3天后，貼壁培養(yǎng)直至長(zhǎng)成單細(xì)胞層，再次懸浮14天后再次貼壁培養(yǎng)，所形成的單層細(xì)胞即為失巢凋亡抵抗細(xì)胞，記為SaOSar。懸浮培養(yǎng)后細(xì)胞變圓，最初為散在的單個(gè)細(xì)胞逐漸成團(tuán)生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的推移細(xì)胞團(tuán)塊不斷增大、致密。
　　 (2)骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗模型的鑒定：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)失巢凋亡細(xì)胞模型中各時(shí)相點(diǎn)懸浮細(xì)胞的凋亡率，貼壁培養(yǎng)SaOS2細(xì)胞的凋亡率(僅指早期凋亡率)為4.34%，懸浮24h之內(nèi)凋亡率上升得最快，達(dá)

25、到20.36%，3天和7天時(shí)分別為33.76%和49.36%，7天后凋亡率上升逐漸變緩，到14天時(shí)為55.28%，14天后凋亡率無(wú)顯著變化。SaOS2與SaOSar細(xì)胞懸浮24h后檢測(cè)凋亡率，前者的早期與晚期凋亡率分別為14.39%和21.79%，而后者僅為5.35%和10.07%。
　　 2.TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過(guò)程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)：
　　 采用熒光定量PCR、免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)方法得到如下結(jié)果：

26、>　　 (1)TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過(guò)程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)。其中懸浮第1天和第7天下降幅度最顯著，都較其前一時(shí)間點(diǎn)下降了65%，懸浮第14天后TSSC3的表達(dá)與未懸浮的SaOS2細(xì)胞相比下降了95%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)相對(duì)于SaOS2細(xì)胞，TSSC3 mRNA和蛋白的表達(dá)在SaOSar細(xì)胞中分別下調(diào)了56%和55%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)TSSC3的表達(dá)在MTF中較hFOB1.19成

27、骨細(xì)胞下降了67%，在MTFar中較MTF下降了15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 綜合以上結(jié)果提示TSSC3可能通過(guò)表達(dá)抑制參與骨肉瘤的失巢凋亡抵抗，進(jìn)而促進(jìn)了骨肉瘤的演進(jìn)。
　　 六、TSSC3通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達(dá)促進(jìn)了MET，抑制了骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能
　　 1.TSSC3的表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力：采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，結(jié)果顯示：overTSSC3和o

28、ver overTSSC3ar細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的距離明顯小于各自的對(duì)照細(xì)胞，而siTSSC3細(xì)胞則明顯大于siCON細(xì)胞。
　　 2.TSSC3的表達(dá)顯著地降低了細(xì)胞的侵襲能力：采用Transwell侵襲小室法測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示：overTSSC3和overTSSC3ar的下室細(xì)胞數(shù)顯著低于各自對(duì)照細(xì)胞，overTSSC3和overCON分別為8±2和105±16，overTSSC3ar和overCONar分別為40±

29、6和179±26，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而siTSSC3的下室細(xì)胞則明顯多于siCON細(xì)胞，siTSSC3和siCON分別為158±11和30±5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.TSSC3的表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子表達(dá)的影響：
　　 采用熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法得到如下結(jié)果：
　　 (1)高表達(dá)TSSC3增加了上皮標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志N-cadherin、Vim

30、entin、Fibronectin以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail、Slug、Smadl、Smad4、ZEB1、ZEB2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說(shuō)明：高表達(dá)TSSC3使骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生了MET。
　　 (2)高表達(dá)TSSC3降低了轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CD44s、CXCR4及金屬蛋白酶家族分子MMP2、MMP7、MMP9、MMP14的表達(dá)，同樣在失巢凋亡抵抗細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TSSC3也得到了同樣的結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，

31、低表達(dá)TSSC3上調(diào)了CD44s、CXCR4、MMP7、MMP14的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說(shuō)明：高表達(dá)TSSC3在基因水平下調(diào)了骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能。
　　 七、TSSC3通過(guò)抑制整合蛋白信號(hào)傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號(hào)通路從而促進(jìn)了骨肉瘤的失巢凋亡，并增加了失巢凋亡細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性
　　 1.TSSC3抑制整合蛋白信號(hào)傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3 K/Akt失巢凋亡抵抗信號(hào)通路從而

32、通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)了骨肉瘤的失巢凋亡：
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞懸浮狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)：與對(duì)照組相比，overTSSC3細(xì)胞團(tuán)塊較小且松散，有較多散在的凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞懸浮3天的失巢凋亡率顯示：SaOS2、overCON、overTSSC3分別為31.20%、31.00%、47.90%(早期凋亡率)；相反，siTSSC3細(xì)胞團(tuán)塊較大且緊密，散在的凋亡細(xì)胞較少。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞懸浮1天的失巢凋亡率顯

33、示：siCON、siTSSC3分別為22.70%、3.52%(早期凋亡率)，且siTSSC3細(xì)胞的失巢凋亡率與抗失巢凋亡細(xì)胞SaOSar相近(8.55%)。結(jié)果表明：TSSC3促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的失巢凋亡。
　　 (2)JC-1染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位的改變，結(jié)果顯示：懸浮3天后，overTSSC3 JC-1單體所占的比例為36.5%，明顯高于對(duì)照細(xì)胞overCON(14.4%)和SaOS2(13.9%)。Western

34、Blot結(jié)果顯示：overTSSC3細(xì)胞溶質(zhì)中Cytc的表達(dá)量顯著高于overCON，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3破壞了骨肉瘤失巢凋亡細(xì)胞的線粒體膜電位從而促進(jìn)了Cytc的釋放。
　　 (3)熒光定量PCR的結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3增加了Puma、Noxa、Bim、Bax、Bak、Cytc、Apaf-1和caspase-3的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，從各個(gè)環(huán)節(jié)促進(jìn)了線粒體途徑的失巢凋亡，差異有統(tǒng)

35、計(jì)學(xué)意義。相反，低表達(dá)TSSC3降低了Puma、Noxa、Bax、Cytc和caspase-3的表達(dá)，同時(shí)升高了Bcl-2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，overTSSC33day細(xì)胞中Bax/Bcl-2的比值為5.97，而overCON3day細(xì)胞中為0.40，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3通過(guò)線粒體凋亡信號(hào)途徑增加了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)失巢凋亡的敏感性。
　　 (4)熒光定量PCR的結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3同時(shí)降低了int

36、egrinβ4與Ezrin的表達(dá)，上調(diào)了integrinα2、integrinβ1的表達(dá)，且TSSC3與Caveolin-1的表達(dá)正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡信號(hào)途徑中的多個(gè)分子。
　　 (5)Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)TSSC3使懸浮細(xì)胞整合素蛋白信號(hào)傳導(dǎo)激酶Src的磷酸化水平降低，P-Akt降低，Akt升高，P-Bad降低，促進(jìn)了Cytc從線粒體釋放到胞質(zhì)，cle

37、aved caspase-3升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3抑制了整合蛋白信號(hào)傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號(hào)通路從而通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)了骨肉瘤的失巢凋亡。
　　 2.TSSC3通過(guò)抑制整合蛋白信號(hào)傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3 K/Akt信號(hào)通路增加了失巢凋亡細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性：
　　 (1)AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞3天，

38、SaOS2、overCON凋亡率分別為59.90%、56.90%，而overTSSC3則達(dá)到78.60%。結(jié)果表明：高表達(dá)TSSC3顯著地增加了失巢凋亡細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。
　　 (2)JC-1染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞3天，SaOS2、overCON、overTSSC3細(xì)胞JC-1單體的比例分別為42.8%、35.6%、63.4%。結(jié)果表明：高表達(dá)TSSC3通過(guò)線粒體通路促進(jìn)了失巢凋亡細(xì)胞化

39、療藥處理后引起的凋亡。
　　 (3)Western Blot檢測(cè)顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞3天，高表達(dá)TSSC3降低了化療藥處理后失巢凋亡細(xì)胞P-Src和P-Akt的表達(dá)，同時(shí)增加了cleavedcaspase-3的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3通過(guò)抑制整合素介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號(hào)增加了失巢凋亡細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。
　　 綜上所述，本研究的主要結(jié)論是：
　　 1.印跡

40、基因TSSC3在骨肉瘤中低表達(dá)，它通過(guò)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抑癌基因作用，其機(jī)制可能為通過(guò)調(diào)控線粒體途徑增加骨肉瘤的基礎(chǔ)凋亡率和化療敏感性。
　　 2.印跡基因TSSC3可通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CD44s、CXCR4和MMP家族分子的表達(dá)促進(jìn)MET，抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。
　　 3.印跡基因TSSC3在骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過(guò)程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制整

41、合蛋白信號(hào)傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號(hào)通路從而促進(jìn)骨肉瘤的失巢凋亡，并增加失巢凋亡細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。
　　 本研究首次報(bào)道了印跡基因TSSC3在骨肉瘤發(fā)生和演進(jìn)過(guò)程中的表達(dá)變化、功能及作用機(jī)制。從印跡基因的角度探討了骨肉瘤失巢凋亡及耐藥的分子機(jī)制。提出了印跡基因TSSC3作為抑癌基因可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡(包括失巢凋亡)，并通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達(dá)促進(jìn)了MET，抑制了骨肉瘤