RNA干擾β-catenin基因?qū)θ斯侨饬鯩G63細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分β-catenin siRNA 對骨肉瘤MG63細(xì)胞生長，凋亡的影響
　　 目的:設(shè)計(jì)針對β-catenin基因CTNNB1的特異性RNA干擾序列，轉(zhuǎn)染人骨肉瘤MG63細(xì)胞系，觀察其對目的基因β-catenin表達(dá)的影響，研究β-catenin基因下調(diào)后對骨肉瘤細(xì)胞生長和凋亡的影響。
　　 方法:根據(jù)GenBank提供的CTNNB1基因序列和NCBI上probe的記載找到一條β-catenin的RNA干擾序列，交

2、由公司合成該序列，并轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞。利用RealtimePCR檢測RNA干擾在mRNA水平上的效果，Western印跡法在蛋白水平上檢測beta-catenin的表達(dá)。Annexin V-FITC /PI染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)果:設(shè)計(jì)beta-catenin siRNA，并可以顯著下調(diào)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞beta-cateninmRNA和蛋白的表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖沒有顯著差異

3、，流式細(xì)胞檢測也沒有明顯的凋亡增加。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了針對CTNNB1基因的特異性siRNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可抑制beta-catenin基因表達(dá)，但對腫瘤細(xì)胞生長和凋亡沒有影響。
　　 第二部分β-catenin siRNA 對骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲的影響及機(jī)制研究
　　 目的:研究 RNA 干擾β-catenin基因表達(dá)后對人骨肉瘤MG63細(xì)胞系侵襲的影響和可能產(chǎn)生的機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用Lipo

4、fectamine ?2000 轉(zhuǎn)染針對β-catenin的特異siRNA 進(jìn)入MG-63細(xì)胞內(nèi)，transwell 法檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力，Western blot 檢測Wnt 靶基因MT1-MMP的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:transwell 法遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較對照組遷移細(xì)胞減少，侵襲實(shí)驗(yàn)也顯示跨過基質(zhì)膠細(xì)胞減少，兩組間有顯著差異。MT1-MMP 蛋白表達(dá)也降低。
　　 結(jié)論:β-catenin siRNA

5、可以有效抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的侵襲，可能是通過抑制MT1-MMP的表達(dá)而達(dá)到的。
　　 第三部分β-catenin siRNA 對骨肉瘤MG63細(xì)胞耐腫瘤藥物的影響及機(jī)制研究
　　 目的:探討siRNA 抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞系β-catenin的表達(dá)對多柔比星耐藥性的影響，及其產(chǎn)生的機(jī)制。
　　 方法:Annexin V-FITC /PI 染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞在多柔比星條件下的凋亡情況。CCK-8 法檢

6、測在不同濃度多柔比星處理后的細(xì)胞活性。應(yīng)用Realtime PCR法檢測NF-kappaB 靶基因XIAP和Bclxl的mRNA表達(dá)，Western blot 法檢測p65，XIAP和Bclxl 蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組凋亡率較陰性對照組和空白對照組明顯降低。CCK-8 法檢測實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性明顯增加。實(shí)驗(yàn)組XIAP和Bclxl的mRNA表達(dá)增加，p65，XIAP和Bclxl 蛋白表達(dá)，較陰性對照組和空